RNA提取時的一些常見問題分析

一、用Trizol 抽提的RNA，用瓊脂糖凝膠電泳，出現許多條帶(至少四條以上)，是哪些原因導致的？

參考見解：

1、是從組織里抽的還是細胞抽的？組織的RNA電泳不理想，但目的條帶仍能跑出來。細胞的電泳相當漂亮，但有時逆轉錄效果反而不好。組織經常出現這種情況，組織抽提的RNA不純，而且多多少少有降解。不過下一步可以接著做逆轉錄，可能對后面的實驗影響不會很大。

2、是mRNA的話，這樣的效果挺不錯的。如果是總RNA，那是降解了。不過細胞的RNA應該不容易降解，可以上樣少點再跑膠。

3、可以試試在70度加熱5分鐘,然后再跑跑電泳可能有意想不到的結果。

4、建再進行RNA精致的過程,也就是Trizol后,加氯仿,吸取上清盡量少吸,然后將其再按規程離心一次吸取上清后加入異丙醇,然后再用70%冰乙醇洗兩次可見RNA,如果還是不行的話最好用柱式吸附柱將上清與70%冰乙醇混合后過柱懷疑這種屬于基因組DNA污染在操作過和的preeogress降解.所以一定要按規程進行抽提。

二、胰腺組織RNA提取時在研磨時總是粘在研缽，怎么處理？有什么好的方法嗎？

參考見解：

取出胰腺組織后立刻浸入液氮中，然后將其轉移至研缽中（研缽要經180度干烤4－8小時，除去RNAase），持續研磨，一邊研磨一邊加液氮，研磨成粉末。此時要注意液氮的補充，如果組織化開就會出現組織粘在研缽內的情況。 研磨成粉末后加入Trizol，此時，由于低溫Trizol也會凍住，持續研磨至Trizol化開并澄清亮，就可以了。然后離心，進行下面的步驟。也可以使用勻漿器，很便宜，也很簡單。當然要經去處RNAase處理。在冰上將組織研磨成勻漿即可。

三、所有的準備工作如干烤、DEPC浸泡等均按分子克隆上說的處理了，可是就是提取不出RNA來。異丙醇沉淀后在管底也有乳白色的東西，用DEPC水溶解卻溶解不了，很粘稠。電泳什么也看不見。用的組織是小鼠的肺和脾臟，TRIZOL用的是GIBCOL的。組織和TRIZOL的比例為每50mg用1ml TRIZOL。為什么？

參考見解：

乳白色的東西有可能就是RNA,一定要溶解,實在不行就在70%乙醇洗過后迅速空氣干燥一下,加DEPC水,還溶解不了就65度加熱10分鐘.好象100mg組織加1mlTRIZOL足夠了。

四、提取酵母的總RNA都用什么方法？有好用的試劑盒嗎？酵母總RNA提取應該注意什么？

參考見解：

使用熱酚法抽提酵母RNA,很好用。

1、 將酵母細胞培養在3ml選擇性培養基中，30℃過夜旋轉培養。

2、 稀釋過夜培養的菌液，重新在10ml培養基中培養細胞。

3、  OD600達到1.0時，收菌，4000rpm/min離心5min,棄培養基。

4、 將細胞懸浮于400μl AE緩沖液（50mM Sodium Acetate,10mM EDTA 調整pH值至5.2）。

5、 ?加入1/10體積的10% SDS，充分混合。 加入等體積在65℃預熱的酸性酚（pH4.5），混合。

6、 ?65℃加熱5min，冰上放置10min。在室溫下8000rpm/min離心10min。

7、 ?取水相,加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），10000rpm/min離心8min。

8、 取水相，加入等體積氯仿/異戊醇（49∶1）10000rpm/min離心8min。

9、 加入1/10體積3M pH5.2的醋酸鈉，2.5倍體積的純乙醇，-20℃過夜沉淀。

10、 沉淀樣品于4℃離心5min，去除液體。

11、 在冰上干燥RNA（放置15min），最后用適量DEPC水溶解RNA。

五、貼壁細胞消化后可不可以離心后加入Trizol呢？有影響嗎？

參考見解:

可以，用少量PBs重懸，然后用trizol提取，不過提取要快，不能存放，因為細胞為活體，表達受外界環境影響，要是已經存放了兩小時，建議重做。

六、在沒有液氮的條件下，直接研磨組織成粉末再加入TRizol中，對RNA提取的質量會不會影響很大？或者在研磨過程中直接加入TRizol研磨直到成粉末，這樣可不可取？

參考見解：

在沒有液氮的條件下，直接研磨組織成粉末再加入TRizol中，這樣RNA早就沒有了。

要是在研磨過程中直接加入TRizol研磨直到成粉末，可以觀察組織,看研磨得什么樣子了,磨的差不多時加trizol,可試一下,鏡下觀察然后確定加入trizol試劑。

七、凍存細胞與新鮮細胞的RNA提取有區別嗎？具體該怎么操作？

參考見解：

新鮮細胞與凍存細胞RNA提取沒什么區別。千萬不能等細胞溶解了存狀態把Trizol直接加到凍存管了，一起化開，振蕩振蕩就可以了。與從組織中提RNA 差不多。

八、做軟骨組織的RNA提取，應當怎樣開始試驗？

參考見解：

1、 按RNA提取的要求處理研缽。

2、 研缽中加入液氮。

3、 將軟骨組織放入盛有液氮的研缽內。

4、 研碎軟骨，液氮蒸發完時加入適量的Trizol。

5、 待Trizol試劑恢復液態后吸入EP管中。

6、 然后按常規方法提取RNA。

九、黃曲霉rna提取（trizol法），加完異丙醇沉淀后得到的是接近透明的沉淀，加75％酒精洗滌后，加depc水能溶解，電泳后跑不出來帶，有的點樣孔很亮，是怎么回事？另外，是不是rna即使降解了也能跑出smear帶？

參考見解：

1、 可能是菌體量過大導致Trizol量嚴重不足，一般為100mg/1 ml Trizol。

2、 存在操作過程中蛋白質殘留過多的現象是點樣口很亮，用氯仿抽提時，盡量不要吸到蛋白層，為保證RNA 的質量，水層可以稍稍多留點；照片說明RNA在 提取過程中降解了，出現了一片Smear。

3、 導致RNA 降解的原因很多，過濾后的菌體用Pbs清洗后是不是用離心的方法收集的菌體。PBS洗滌后有沒有把PBS完全吸盡；沒吸盡的話可能導致trizol不能完全把菌體中的RNA酶抑制住從而導致RNA被完全降解。

4、 液氮研磨的時間并不重要，最好是快速而充分的研磨才是最必要的，而且中途不能讓其解凍。覺得可以了就馬上加trizol 一直研磨直至其變得像潤膚霜就可以繼續下面步驟了重要的是菌體量和 Trizol加的量有多大，如果Trizol加量相對少，就不能很好的裂解組織和細胞，同時也不能很好的保護RNA,RNA會被RNAase降解掉，所以可以適當增加Trizol的量。

5、 再有操作過程是否規范，最好都是用過濾嘴槍頭，最好都是經過depc處理tip and tube 使用一次的橡膠手套，全程帶口罩等等細節。至于電泳的問題只要是RNA專用的電泳槽， 電泳槽的問題不大，最主要是在提取的過程中RNA降解了。

十、提肝的RNA,效果很好,但提腦和卵巢卻提不出來,都是同期采的樣,不知道問題出在那里?

參考見解：

1、 使用組織提取RNA時組織必須新鮮,時間一長RNA便容易被內源性的RNA酶降解,即使把組織放在-80也阻止不了RNA酶的作用.如果用trizol提的話應該趁組織新鮮時先進行勻漿,再把勻漿液放于-80凍存.因為trizol本身含有酚,對RNA有一定的保護作用.

2、 DNA和RNA 的含量都是非常高的,腦卵巢中要少.注意RNase.最后溶解RNA加的DEPC處理水不要太多.在提取的過程中也要注意外源性RNA酶的降解，如果用trizol法的話，一般先降trizol加到研磨器中再加入組織研磨，整個過程中都要帶手套，所有材料最好都要用DEPC水浸泡以后再高壓。