血清中 miRNA 抽提和實驗設計經驗談
人體內的血液循環系統猶如印度的圣河 – 恒河，河水中攜帶的養分滋養著古老的大地；洗滌帶走地上的一切污穢，人們的一生都在河水中完成。如此的恒河可以想象，河水中充斥著各種物質，有廢物有養分，只要你想都可以從河水中撈取。同樣的我們的循環系統如同恒河；流動的血液如同恒河水，身體所需的ㄧ切由血液運送，身體產生的廢物也由血液清運，同樣可以想象血中的成份也是包羅萬象。
如果我們想知道大地有多純凈或污染有多嚴重，只要取一瓢水加以檢視就可以知道答案；而相同的想了解人的生理狀況，取一滴血加以檢驗也可以知道端倪，但是做這些檢測并非漫無目標的，必須要知道哪ㄧ些物質是所謂的指針，在生物體內的這些指針就是我們熟知的生物標記(biomarker)。生物標記的研究和應用已有ㄧ段光景，各項代謝疾病的篩檢廣泛的被使用，而在癌癥的篩檢也已經有ㄧ些不錯的生物標記，例如 AFP (Alpha-fetoprotein)。順著 microRNA (miRNA) 的發現和研究熱潮，已經約有 1000 個 miRNA 被發掘表現于人體中，miRNA 調控人體內基因表現的生理功能也為人們所熟知，加上 miRNA 相對于蛋白質標志的高穩定性，伴隨著檢測技術的一日千里，讓血液中的 miRNA 表現成為新一代尋找生物標記的標的。本文內容介紹主要是血清 miRNA 的萃取和芯片實驗所累積的經驗，和讀者分享實驗上遇到的一些難題和解決的方法。
血液中 miRNA 的組成
血液中的 miRNA 到底是從何而來? 要往哪里去? 這些 miRNA 的生理功能是什么?以上這三個問題是很多研究人員關心的問題，事實上這些問題目前并沒有很明確的答案，我們知道 miRNA 是內生性的短片段 RNA，長度約 17 到 23 核苷酸，miRNA 可以藉由和信息 RNA (mRNA) 結合誘導信息 RNA 的降解，進而調控信息 RNA 和相對蛋白的表現。根據一些論文的揭示1和實驗室實際的操作經驗顯示，正常人的血液中 miRNA 的含量是極微量的，但是在病人和檢體制備不佳的血液樣本中卻可抽取到較大量的 miRNA，根據這些觀察現象的合理臆測，病人血清中 miRNA 的來源，很有可能是因疾病造成的組織壞死或細胞凋亡破裂而流泄出來的胞內 miRNA，經由病人和正常人的基因表現的芯片圖譜比較，結果也傾向有或無表現的差異，而非特定 miRNA 表現量上升；換言之，我們觀察到相關的研究中，病人的 miRNA的表現數目增加了，而分析ㄧ些在正常人和病人中都有表現的 miRNA，表現量的高、低反而是其次的表征。
因此數據分析的邏輯和方法也必須根據之而調整，但這些呈現異位性表現(ectopic expression)的 miRNA 并不影響其成為診斷疾病和預后評估的標志的可能性。已經有一些研究指出，這些不經常表現在循環系統的 miRNA 可以成為良好的疾病診斷標志，如 miR-141 可以作為前列腺癌的指標，miR-499 及 miR-208 和心肌梗塞(myocardial infraction)相關，miR-122 和藥物造成的肝臟損傷有關1。
血清中 miRNA 抽提的挑戰
1. 檢體的備制：血清(serum)好還是血漿(plasma)好?
臨床上會根據檢驗的標的來選擇血液檢體的保存及制備方式，血清和血漿都是來自血液檢體的成分，但是根據制備的方式導致本質上含有成分有所不同?；谥苽涞姆椒芍?，血清是血液經由凝血反應后，再經由離心沈淀所得到的上清液。而血漿則是血液在不凝血的狀況下，經由離心去除血球后的液體。
然而有文獻指出，針對同一個人的血清和血漿樣本抽提出來的 miRNA 的總量作比較，很明顯的血清抽提的總量明顯比血漿抽提的來得高，這意謂著制備的方法也會影響miRNA 的抽提，據推測這些 miRNA 可能是因為凝血反應，血小板或紅血球破裂后釋出的物質，其中包含 miRNA，雖然大部分的實時定量聚合鏈反應(q-PCR)驗證結果顯示，血漿和血液的 miRNA 的表現圖譜并無顯著差異，然而這個已經存在的風險，可能在研究設計也是需要被考慮，因此就理論上來說，是以血漿的檢體較適合作為生物標記的找尋1。
2. 檢體的備制或保存不良是否可用?
已知血清或血漿中的 miRNA 的來源可能來自胞內和胞外，尤其是血球(紅血球或白血球等)，因此處理方式不當會造成檢體的污染，改變 miRNA 的組成和表現量，造成研究結果的偏差，尤其紅血球的溶血現象影響甚劇，不僅會造成紅血球 miRNA 污染而且紅血球中的大片段 mRNA 亦會造成定量的失準和因降解而形成實驗的偽陽性產生(圖一)。
因此備制檢體時也要避免造成血球破裂的動作，如用太細的針頭抽血、或檢體保存不當造成溶血、或病人本身因疾病或治療造成的敗血或溶血現象可能也是必須列入評估的考慮因素。此外抗凝血劑的使用必須避免使用含有肝素 heparin 的凝血管，已知 heparin 會抑制反轉錄 (reverse transcription) 和聚合酶 (polymerase) 的反應，如果檢體會進行 q-PCR 的驗證一定要避免。同樣的血液檢體也含有抑制反轉錄和聚合酶的成分，如果萃取時沒有移除干凈則會造成后續實驗的失敗產生。
圖一.(左圖)為血清抽提miRNA 后，經由 Agilent Bioanalyzer 2100 分析的 RNA 圖譜，結果顯示提取成功，提出物中只有 miRNA 片段留存。(右圖)同左圖的實驗操作步驟，結果顯示雖然提取是成功的，但是提出物中出現大片斷的可疑DNA 或 RNA 片段，可能原始的檢體中有溶血的現象等干擾因素。
miRNA 的抽提方法
基本上血液中的 miRNA 也是 RNA，只是片段較短，因此萃取的方式和原理和其他 RNA 的萃取方式大同小異，目前市面上也有許多的萃取套組可供選擇，萃取的方式以有機溶劑如：Trizol LS，或通管柱(column)的方式進行，均可以有不錯的回收率，抽提方式可以參考今年 4 月份華聯快訊 – RNA 抽提。只有一點要特別提醒讀者的，使用有機溶劑方式萃取(phenol-chloroform)容易會有鹽類和有機溶劑殘留，會影響定量和抑制后續實驗操作反應，因此操作上必須避免抽取到有機溶劑，可增加酒精清洗步驟一到兩次，洗去殘留鹽類。當然使用管柱抽提可以輕易避免這些潛在問題的風險。
miRNA 的定量
在抽提成功的情形下，血清和血漿中僅含有少量的 RNA，1 mL 血的抽提總量可能都在 ng 甚或 pg 等級，這樣的結果意謂著，運用現行的分亮度計來測 OD 是不可行的(以 NaroDrop 為例：待測濃度需高達10ng/uL才可信)，而Agilent bioanalyzer 2100 也僅能做到定性的檢測，沒法做精準的定量。檢視現行被使用的定量方法大概有：
(一)在等體積的血清或血液樣本中加入外控核酸(spike)，經由抽提步驟后可經由偵測外加的 spike 來校正抽提的總量及效率，作為校正檢體因抽提效率或誤差造成的差異。然而這只適用在檢體備制完美及控制抽取技術無誤，對于個體表現差異大和檢體備制質量不一的檢體，并沒有辦法達到管控的效用；
(二)經過分亮度計測 OD 加以定量，但是除非抽提出的量達到分亮度計的可信水平，否則這些數值大概都是假訊號，并不足以采信；
(三) 使用內控基因的表現量來做為校正。但根據研究指出其實血清或血漿中 miRNA 的表現數量是有很大的個體差異的，以正常人當研究對象分析其表現的 miRNA 數量，最低 123 個；最高有 296 個1，可以有高達兩倍的差距，再加上沒有適合的內控基因 (internal control gene) 可以做為控制組，公認常用的內控基因 U6 或 SNORD RNAs 等，在個體間的表現也是差異很大并不適用1,2。因此透過 Agilent Bioanalyzer 2100 的結果進行 miRNA相對定量；或從等體積血清抽提出 miRNA 再等比例取出進行實驗，似乎是較可信的做法，但是還是要取決于實驗的設計來決定。
參考資料
(1) Wang K., et al., Comparing the MicroRNA Spectrum between Serum and Plasma. PLoS One. 2012;7(7)
(2)_Huang Z., et al., Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer. Int J Cancer. 2010 Jul 1;127(1):118-26.
