RNA干擾技術及其應用
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是正常生物體內抑制特定基因表達的一種現象，它是指當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默的現象，這種現象發生在轉錄后水平，又稱為轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。
外源dsRNA 進入細胞后產生的小分子干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）的反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC具有結合和切割mRNA的作用而介導RNA干擾的過程。RNAi具有特異性和高效性。
這種技術已經成為研究基因功能的重要工具，并將在病毒病、遺傳性疾病和腫瘤病的治療方面發揮重要作用。
近年來，RNA干擾的研究成為熱點，預測未來10年間最有可能出重大成果的領域之一，并被《Science》評選為2002年度最重要科技突破的首位。RNAi是細胞本身固有的對抗外源基因及其侵害的一種自我保護現象，是雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平關閉相應序列及基因的表達使其沉默的過程。
RNAi技術的應用領域已經從基因組學研究逐步擴展到醫學領域并作為基因治療手段。利用RNAi不僅能提供一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段，而且有可能在基因功能測定和基因治療等方面開辟一條新思路，因此包括動物醫學在內的諸多領域的應用也有非常廣闊的前景。
1.RNA干擾的發現
1995年，康乃爾大學的Su Guo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)的par-1基因時，發現了一個意想不到的現象。
她們本想利用反義RNA技術特異性地阻斷上述基因的表達，而同時在對照實驗中給線蟲注射正義RNA以期觀察到基因表達的增強，但得到的結果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑。這是與傳統上對反義RNA技術的解釋正好相反。該研究小組一直未能給這個意外以合理解釋。
1998年，華盛頓卡耐基研究院的Fire和麻省大學醫學院的Mello首次在秀麗新小桿線蟲中證明上述現象屬于轉錄后水平的基因沉默。他們發現Su Guo博士遇到的正義RNA抑制基因表達的現象，以及過去的反義RNA技術對基因表達的阻斷，都是由于體外轉錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。
當他們將體外轉錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發現，基因抑制效應變得十分微弱，而經過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應基因的表達，其抑制基因表達的效率比純化后的反義RNA至少高2個數量級。該小組將這一現象稱為RNA干擾。
在1999年短短的一年間,發現RNA干擾現象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物中細胞。2000年，又先后發現小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在ＲＮＡ干擾現象。
2.RNA干擾的作用機制
當病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內，并利用宿主細胞進行轉錄時，常產生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產生反應，其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA（大約21～23 bp），即siRNA。
siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內一些酶(包括內切酶、外切酶、解旋酶等)結合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。
RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區進行特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。
siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。
RNAi發生于除原核生物以外的所有真核生物細胞內。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達具有潛在高效性，任何導致正常機體dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應基因沉寂。所以正常機體內各種基因有效表達有一套嚴密防止dsRNA形成的機制。
RNAi干擾現象具有以下幾個重要的特征：
①RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制；
②RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應的單個內源基因的mRNA；
③RNAi抑制基因表達具有很高的效率，表型可以達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子(數量遠遠少于內源mRNA的數量)就能完全抑制相應基因的表達，是以催化放大的方式進行的；
④RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限，在不同細胞間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳等特點;
⑤dsRNA不得短于21個堿基，并且長鏈dsRNA也在細胞內被Dicer酶切割為21 bp左右的siRNA，并由siRNA來介導mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導特異的RNA干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和凋亡；
⑥ATP依賴性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現象降低或消失顯示RNA干擾是一個ATP依賴的過程。可能是Diecer和RISC的酶切反應必須由ATP提供能量。
3.RNA干擾的應用
RNA干擾現象的發現及其在生物中存在的普遍性，以及RNAi作用機制和生物學功能的初步闡明，為RNAi的應用提供了理論基礎。RNAi目前已經在功能基因組學研究、微生物學研究、基因治療和信號轉導等廣泛的領域里取得了令人矚目的進展，使其在醫學領域包括動物醫學領域在內的應用有著廣闊的前景。
3.1 研究基因功能的新工具
由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。
已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以控制在發育的任何階段，產生類似基因敲除的效應。與傳統的基因敲除技術相比，這一技術具有投入少，周期短，操作簡單等優勢，近來RNAi成功用于構建轉基因動物模型的報道日益增多，標志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。
3.2 病毒性疾病的治療 加州大學洛杉磯分校和加州理工學院的研究人員開發出使用RNAi技術來阻止艾滋病病毒進入人體細胞。
這個研究小組設計合成的lenti病毒載體引入siRNA，激發RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5進入人體外周Ｔ淋巴細胞，而不影響另一種HIV-1主要的coreceptor-CCR4，從而使以lenti病毒載體為媒介引導siRNA進入細胞內產生了免疫應答，由此治療HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。
RNAi還可應用于其它病毒感染如脊髓灰質炎病毒等，siRNA已證實介導人類細胞的細胞間抗病毒免疫，用siRNA對Magi細胞進行預處理可使其對病毒的抵抗能力增強。在最近全世界約30個國家和地區散發或流行的嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的防治研究中，RNAi也受到了重視。
siRNA在感染的早期階段能有效地抑制病毒的復制，病毒感染能被針對病毒基因和相關宿主基因的siRNA所阻斷，這些結果提示RNAi能勝任許多病毒的基因治療，RNAi將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴重的動物傳染病的防治具有十分重大的意義。
3.3 遺傳性疾病的治療 美國西北大學的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人發現RNAi同脆性Ｘ染色體綜合征（與FMR-1基因異常有關的導致智力低下的染色體病）之間的關系密切，揭示了與RNAi相關機制的缺陷可能導致人類疾病的病理機制。
遺傳性疾病的RNAi治療成為當今研究RNAi的又一大熱點。
3.4 腫瘤病的治療 腫瘤是多個基因相互作用的基因網絡調控的結果，傳統技術誘發的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設計針對這一區段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產生多個基因同時剔除的表現.
也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關的基因同時剔除。Maen等應用RNAi技術成功地阻斷了MCF7乳腺癌細胞中一種異常表達的與細胞增殖分化相關的核轉錄因子基因Sp1的功能。
總之，隨著RNAi機制研究的深入和RNA干擾技術的日趨完善，它作為一種便捷實用的基因組研究方法和基因治療藥物，預示著一個嶄新的RNA時代即將來臨。
盡管仍有一些問題亟待研究，如外源轉基因如何產生dsRNA？到底有哪些核酸酶參與了dsRNA和mRNA的切割，其詳細機制如何？以及最近發現植物的一種鈣調素相關蛋白參與PTGS的弱化，提示鈣信號可能調節PTGS或RNAi等問題。
但細胞中這種古老、多能的細胞水平的監督系統經過千萬年的選擇和進化的考驗，毫無疑問是一件無價之寶。該技術將被廣泛地用于農、林、牧、漁等多種領域，具有巨大的科研、經濟和社會價值。
