RNAi基因沉默方法
2006年諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主CraigMello和AndrewFire發(fā)現(xiàn)，他們能夠?qū)⒍蘎NA 分子插入到線蟲中并沉默特定基因的表達(dá)。今天，研究人員也常常使用這種強(qiáng)大的RNA 干擾方法來研究哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的特定基因功能。
為了進(jìn)行這種基因沉默實(shí)驗(yàn)，研究人員通常需要依賴化學(xué)合成的RNA 分子，而這個(gè)合成過程是相當(dāng)昂貴的。《冷泉港實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》（ColdSpringHarborProtocols）上的一篇免費(fèi)文章就這個(gè)問題進(jìn)行了討論。該文章描述了一種能產(chǎn)生沉默RNA （esiRNA ）以有效靶向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的任何基因的很劃算的方法。
這篇文章描述了如何在體外利用酶合成RNA 分子，該方法利用克隆的感興趣基因作為模版。接著，這些RNA 分子被隨機(jī)分割成短的片段，純化后用于RNA 干擾實(shí)驗(yàn)。
這種方法是由德國(guó)馬克思?普朗克分子細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)研究所的FrankBuchholz研究組發(fā)明，能夠用于制備大的esiRNA 庫(kù)以用于大規(guī)模的基因功能研究。
本月《冷泉港實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》中另外一篇重點(diǎn)文章還描述了如何利用胎鼠培養(yǎng)胸腺細(xì)胞。胸腺是脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的重要組成部分――T細(xì)胞的發(fā)源地。胎鼠胸腺器官培養(yǎng)是體外研究T細(xì)胞成熟過程的唯一可利用系統(tǒng)，并且這種操作方法將能幫助希望了解T細(xì)胞成熟機(jī)制的研究人員。該文章的作者是英國(guó)伯明翰大學(xué)MRC免疫調(diào)節(jié)研究中心的GrahamAnderson和EricJ.Jenkinson撰寫。
最新發(fā)布的這個(gè)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)的文章還包括成像斑馬魚的神經(jīng)元活動(dòng)、分析果蠅和青蛙的基因表達(dá)模式、制備用于基因分型研究的哺乳動(dòng)物DNA和鑒定蛋白質(zhì)相互作用的文章。
RNA i現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，加速了后基因組時(shí)代基因功能的研究步伐，更重要的是，RNA i自身可以應(yīng)用于臨床治療，有望在未來幫助科學(xué)家開發(fā)出治療疾病的新療法。美國(guó)《科學(xué)》(Science)雜志連續(xù)三年將其評(píng)為十大科學(xué)突破之一，并于2002年將其評(píng)為十大科學(xué)突破之首。
科學(xué)家公認(rèn)，RNA i的研究將是未來十年生物醫(yī)藥研究中最激動(dòng)人心也最有可能產(chǎn)生豐富成果的領(lǐng)域之一。在提出后短短幾年，RNA i這一項(xiàng)舉世矚目的技術(shù)得到諾貝爾獎(jiǎng)的青睞和肯定，其發(fā)現(xiàn)者Dr.AndrewFire和Dr.CraigMello獲得了2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
RNA i是在研究秀麗新小桿線蟲（C.elegans）反義RNA （antisenseRNA ）的過程中發(fā)現(xiàn)的，由dsRNA 介導(dǎo)的同源RNA 降解過程。1995年，Guo等發(fā)現(xiàn)注射正義RNA （senseRNA ）和反義RNA 均能有效并特異性地抑制秀麗新小桿線蟲par-1基因的表達(dá)，該結(jié)果不能使用反義RNA 技術(shù)的理論做出合理解釋。直到1998年，克雷格?梅洛博士和卡耐基研究院的Dr.AndrewFire證實(shí)Guo等發(fā)現(xiàn)的正義RNA 抑制同源基因表達(dá)的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA 中污染了微量dsRNA 而引發(fā)，并將這一現(xiàn)象命名為RNA i。
此后dsRNA 介導(dǎo)的RNA i現(xiàn)象陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等多種真核生物中，并逐漸證實(shí)植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA 介導(dǎo)的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）現(xiàn)象均屬于RNA i在不同物種的表現(xiàn)形式。
1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)度為25nt的RNA 中間產(chǎn)物。2000年，Zamore和Hammond等使用體外培養(yǎng)的果蠅細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，外源性dsRNA 通過耗能過程降解成21-23nt的小干擾RNA （smallinterferingRNA ，siRNA ）引發(fā)RNA i。
2000年，Wianny和Svoboda等分別證實(shí)在小鼠胚胎細(xì)胞和卵母細(xì)胞中dsRNA 能引發(fā)RNA i效應(yīng)。2001年，Elbashir等證實(shí)21nt的siRNA 可在避免激活dsRNA 依賴的蛋白激酶(dsRNA -dependentproteinkinase，PKR)和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylatesynthetase，2',5'-OAS)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的同時(shí)，有效抑制人胚腎293細(xì)胞、Hela細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。
2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1啟動(dòng)子構(gòu)建了小發(fā)卡RNA （smallhairpinRNA ，shRNA ）表達(dá)載體pSUPER，并證實(shí)轉(zhuǎn)染該載體可有效、特異性地剔除哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)，為利用RNA i技術(shù)進(jìn)行基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。
