苯酚法提取酵母RNA
(一)原理
細胞內大部分RNA 均與蛋白質結合在一起,以核蛋白的形式存在。因此,提取RNA時要把RNA與蛋白質分離并除去。將細胞置于含有十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)的緩沖液中,加等體積水飽和酚,通過劇裂振蕩,然后離心形成上層水相和下層酚相。核酸溶于水相,被苯酚變性的蛋白質或者溶于酚相,或者在兩相界面處形成凝膠層。
本實驗采用的0.15mol/L 緩沖液系統可使大部分RNA-蛋白復合物解離,而DNA-蛋白復合物只有極少部分解離;用酚處理時DNA-蛋白復合物變性,在低溫條件下從水相中除去,這樣得到的RNA 制品中混雜的DNA 極少。用氯仿-異戊醇繼續處理RNA 制品,可進一步除去其中少量的蛋白質。最后用乙醇使RNA 從水溶液中沉淀出來。本法得到的RNA 不僅純度高,而且多呈自然狀態,可供繼續研究之用。
(二)主要儀器和試劑
1、儀器
(1)臺式高速離心機(10 000r/min)
(2)水浴
(3)Eppendorf 管(1.5mL)
(4)紫外可見分光光度計
(5)冰箱或冷柜(0~4℃)
(6)振蕩器
(7)分析天平(精確至0.1mg)
(8)真空干燥器
2、試劑(均為分析純)
(1)SDS-緩沖液:0.3% SDS,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L 乙酸鈉,用乙酸調到pH5.0。
(2)飽和酚液:重蒸苯酚用(1)溶液飽和。
(3)氯仿-異戊醇液:24﹕1(V/V)。
(4)含2%乙酸鉀的95%乙醇溶液。
(5)無水乙醇
(6)乙醚
(7)溶菌酶(B.R.)(1mg/mL)
(三)操作步驟
1、取1g 活性干酵母在研缽中研碎,加10mL SDS-緩沖液使成勻漿,洗入各Eppendorf管(略少于管容積的一半),加溶菌酶0.1mL,混勻,室溫靜置10min,再加等體積飽和酚液,室溫下劇烈振蕩5min。
2、置冰浴中分層,在0~4℃低溫環境下,10 000r/min 離心10min.吸出上層清液,轉入新的Eppendorf 管,加等體積氯仿-異戊醇,室溫下劇烈振蕩2.5min,然后10 000r/min 離心5min。
3、吸出上層清液,轉入另一新Eppendorf 管,加2 倍體積95%乙醇(含2%乙酸鉀),在冰浴中放置30min,使RNA 沉淀。
4、再以10 000r/min 離心5min,棄上清液,沉淀用少許無水乙醇和乙醚各洗一次,即加乙醇或乙醚,迅速離心各1min,保留沉淀。
5、傾去乙醚后,減壓真空干燥,準確稱重,記錄。
6、RNA 制品純度的測定及RNA 提取率的計算與濃鹽法相同。