原位雜交組織化學實驗技術
第一節 原位雜交組織化學概述
一、核酸分子雜交技術
1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。
自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，核酸自動合成儀的誕生，大大豐富了核酸探針的來源，新的核酸分子雜交類型和方法不斷涌現。
按其作用方式可大致分為固相雜交和液相雜交兩種：液相雜交是指參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中，而固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈固定在固體的支持物上（常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應的核酸鏈游離在溶液中。
固相雜交有菌落原位雜交（colony in situ hybridization）、斑點雜交法（Dot blot）、Southern印跡雜交（Southern blot）、Northern印跡雜交（Northern blot）和組織原位雜交（Tissue in situ hybridization），即原位雜交組織化學技術和原位雜交免疫細胞化學技術。
液相分子雜交技術包括吸附雜交、發光液相雜交、液相夾心雜交和復性速率液相分子雜交等（詳見第十八章 ）。
二、原位雜交組織化學技術的由來及發展
原位雜交組織（或細胞）化學技術簡稱原位雜交（In situ hybridization），如上所述，屬于固相核酸分子雜交的范疇。但它區別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術。菌落雜交系細菌裂解釋放出DNA，然后進行雜交。
Southern印跡雜交法是以鑒定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印跡雜交法是用以檢測某一特定的RNA片段的。它們都只能證明該病原體、細胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細胞或組織中存在的部位。
1969年美國耶魯大學Gall 和Pardue首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。
與此同時，Buongiorno Nardelli和Amaldi,John及其同事等相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位，從而創造了原位雜交細胞或組織化學技術。
Orth（1970）應用3 H標記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細胞中的定位，但當時的工作多采用冰凍組織切片或培養細胞，探針均采用同位素標記。
由于同位素標記探針具有放射性既污染環境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點，科學工作者們開始探索用非放射性的標記物標記核酸探針進行原位雜交。Bauman（1981）等首先應用熒光素標記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。
Shroyer（1982）報道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）標記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來識別雜交后的探針，最后經免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應用不夠普遍。
Pezzella（1987）創建了用磺基化DNA探針來做細胞或組織原位雜交的方法，其基本原理是使DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆抗體識別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結合的單克隆抗體，從而對雜交結合的探針進行定位。
本法的優點是磺基化DAN探針標記簡便，不需作缺口平移標記，敏感度也較高。但自生物素和高辛標記探針技術建立后，已有取而代之的趨勢。
生物素標記探針技術是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素標記的探針在組織切片上檢測了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統顯示病毒DNA在細胞中的定位。
生物素標記探針技術目前已被廣泛應用，特別是在病毒學和病理學的臨床診斷中。這種生物素標記技術又叫酶促生物素標記技術。另一種叫光促生物素標記核酸技術，該技術是用光敏生物素（Photobiotin）標記核酸。
目前應用的光敏生物素有乙酸鹽和補骨脂素生物素，它們都是由三個部分組成：光敏基團、連結臂和生物素。在強光下，不需酶反應，光敏生物素的光敏基團即可與核酸中的堿基相結合。
光敏生物素標記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標記效率不高，每100～150個堿基才能標記一個生物素，對于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標記數過少而影響靈敏度（Forster et al 1985）。
近年來，地高辛（Digoxigonin）標記技術引起科技工作者的極大興趣。Boeringer Mannhem Bio－chemisca于1987年將地高辛標記的有關試劑及藥盒投放市場。和其它非放射性標記物一樣，地高辛較放射性標記系統安全，方便、省時間。
同時在敏感性和質量控制方面比生物素標記技術要優越，可以檢測出人基因組DNA中的單拷貝基因。地高辛標記法顯示的顏色為紫藍色（標記堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色系統），有較好的反差背景。
核酸探針根據標記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。根據探針的核酸性質不同可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針等。DNA探針還有單鏈DNA（Single stranded, ssDNA）和雙鏈DNA（Double stranded, dsDNA）之分（詳見十九章?。?。
早期應用的主要是DNA探針，繼之Temin在70年代研究致癌RNA病毒時制備了cDNA探針（complementary DNA），其基本原理是以RNA為模板，經逆轉錄酶（reverse transcriptase）又稱為RNA指導的DNA聚合酶催化產生的。該酶以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉錄。CDNA是指互補于mRNA的DNA分子。
RNA探針是將特異性的cDNA片段插入含有相當的RNA聚合酶啟動子的轉錄性載體。這類載體包括pSP64和pSP65，它們具有不同的啟動子在多克隆位點的各側。Psp64和pSP65在sP6啟動子的多克隆位點的方向是不同的。
通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉錄方向，即以哪條DNA鏈為模反轉錄RNA。從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針（Sense probe）和與mRNA互補的反義RNA探針（antisense probe），又稱互補RNA探針（complementary RNA probe , cRNA）。
通常用同義RNA探針做為反義RNA探針的陰性對照。由于RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應極高。有報告認為其雜交率高于DNA探針的8倍。
DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價格低廉的優點，也可進行放射性與非放射性標記，但其特異性不如克隆性探針強，亦不如其雜交信號高。
原位雜交組織化學技術在近20年的發展可以說是飛躍的，其突出的特點是由分子遺傳學研究提供的探針大量增加，探針生產的可靠性和速率大大發展了，更重要的是非放射性標記物的發展使原位雜交組織化學技術在不久的將來將和現今的免疫細胞化學技術一樣成為實驗室的常規技術和臨床日常應用的診斷技術。
新的非放射性標記技術正在繼續不斷涌現。Coulton（1991）建議將非放射性標記技術更名為親合復合物標記技術（Affinity Complex Labelled Probes, ACLP ）。因為“非（non）“在英文里是一個否定的名詞，而且根據非放射性標記技術的原理是將一個標記物利用其親合性，應用直接或間接的方法結合在核苷酸分子上。
原位雜交組織化學技術在生命科學的研究中可視為一項革命性的技術。它使它們的研究從器官、組織和細胞水平走向分子水平。為各個學科的研究帶來突破性的進展。其中特別突出的是細胞或組織的基因表達、染色體分析、病毒診斷和發育生物學。我們在下節 將詳加敘述。
三、原位雜交組織化學技術的基本方法
如前所述，由于核酸探針的種類和標記物的不同，在具體應用的技術方法上也各有差異，但其基本方法和應用原則大致相同。大致可分為：
①雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；
②雜交；
③雜交后處理；
④顯示（visual－ization）：包括放射性自顯影和非放射性標記的顯色。
（一）固定
原位雜交組織化學技術（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定劑的應用和選擇上應兼顧到三個方面：保持細胞結構，最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；使探針易于進入細胞或組織。DNA是比較穩定的，mRNA是相對穩定的但易為酶合成和降解。
RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。
在解釋ISHH的結果時應考慮到取材至進入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。
其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定劑也能獲得較滿意的效果。對于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。
組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數月之久不會影響雜交結果。在病理學活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。
同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。其它固定劑如應用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。各種固定劑均有各自優缺點，如沉淀性（Precipitating）固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結構有損傷。
戊二醛能較好地保存RNA和組織形態結構，但由于和蛋白質產生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認為ISHH較為理想的固定劑。
?。ǘ┎Ｆ徒M織切片的處理
1．玻片的處理玻片包括蓋片和載片應用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放（硅化方法見附錄）。
由于ISHH的實驗周期長，實驗程序繁雜，因此，要應用粘附劑預先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優點是價廉易得，但在長周期實驗過程中，粘附效果不夠理想。
多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價格昂貴，需進口。近年Vector Lab (U.S.A.)推出一種新的粘附劑叫Vectorband Reagent,每一單位包裝可制備500～700張載玻片，粘附效果極佳，價格較多聚賴氨酸便宜，制片后可長期保存應用。目前國內尚無生產，需國外進口（配方見附錄2）。
2．增強組織的通透性和核酸探針的穿透性此步驟根據應用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質產生廣泛的交叉連接就需要應用較強的增強組織通透性的試劑。
增強組織通透性常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存最和影響組織結構的形態，因此，在用量及孵育時間上應慎為掌握。
蛋白酶K（Proteinase K）的消化作用在ISHH中是應用于蛋白消化的關鍵步驟，其濃度及孵育時間視組織種類、應用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應用酶k 1μg/ml(于0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0緩沖液中),37℃孵育15～20min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態為目的。
蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質的作用，從而提高雜交信號。在蛋白酶K消化后，應用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結構，通常用4%多聚甲醛再固定。
Burns等（1987）報告應用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用0.1n HCl 配）37℃、30min進行消化，所獲實驗結果優于蛋白酶K。
不少實驗工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以減低靜電效應，減少探針對組織的非特異性背景染色。
有的作者除在室溫下浸于上述溶液10min外，還在預熱37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中預雜交15min，然后用2×SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min。但Heinz、Hofer等一些著名學者卻對此持有異議，根據他們的實驗和經驗證明，乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。
3．減低背景染色和免疫細胞化學染色一樣ISHH實驗程序中，如何減低背景染色是一個重要的問題。ISHH中背景染色的形成是諸多因素構成的。雜交后（Posthybridization ）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。
預雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。將組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。
有的實驗室在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，以減低殘留的和內源性的RNA酶，減低背景染色。
4．防止RNA酶的污染由于在手指皮膚及實驗用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結果，在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫（240℃）烘烤以達到消除RNA酶的目的。
要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。有條件的國外實驗室在消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標記和防止取出時空氣污染。在無高溫消毒的烤箱時，亦可用國內出產的衛生蒸汽消毒鍋（山東新華醫療器材廠生產）。雜交前及雜交時所應用的溶液均需經高壓消毒處理。
?。ㄈ╇s交（Hybridisation）
在ISHH，整個實驗周期是比較長的，實驗程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個實驗中可被認為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進入細胞或組織與其內的靶核苷酸相結合。因此，雜交是ISHH中關鍵的而且是最重要的一個環節 。
雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。國內向正華等采用無菌的蠟膜代替硅化的蓋玻片也可獲得滿意的實驗結果。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導致雜交液的蒸發。
因此，也有為穩妥起見，在蓋玻片周圍加液體石蠟封固的，但作者認為這并不十分必要，因封固的石蠟在高溫下融解反易導致雜交液的污染，必要時可加橡皮泥封固蓋片四周。
硅化的蓋玻片的優點是清潔無雜質，光滑不會產生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達到覆蓋和防止蒸發的作用。
在孵育時間較長時，為保證雜交所需的濕潤環境，可將復有硅化蓋玻片進行雜交的載片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate, SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高溫破壞）中進行孵育。雜交液的成分和預雜交液基本相同，所不同的是加入了標記的核酸探針和硫酸葡聚糖（配方見附錄）。
如前所述，雜交前的準備只是為雜交的成功奠定基礎，要獲得滿意的實驗結果，在雜交這一實驗過程中還須注意以下的環節 。
1．探針的濃度很難事先確定每一種實驗探針的濃度，但要掌握一個原則，即探針濃度必須給予該實驗最大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針濃度有關。根據國內外實驗工作者的經驗，認為最佳原則應是應用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結合度為目的。這和我們在免疫細胞化學試驗中選擇抗血清的最佳工作濃度的原則一樣。
探針濃度依其種類和實驗需要略有不同，根據筆者的經驗及所查閱文獻，在原位雜交細胞化學中，探針濃度為0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。根據Heinz 、Hofelt實驗室經驗，對放射性標記的dsDNA或cRNA探針，其濃度在2～5ng/μl。Conlton認為生物素標記探針，其最佳濃度在0.5～5ng/μl。
作者在英皇家研究生院Polak教授實驗室應用于放射性標記cRNA探針的濃度為0.5ng/μl，而在非放射性標記（生物素或地高辛）cRNA探針濃度為2.5ng/μl，放射性標記DNA探針濃度為1.0ng/μl。向正華等應用地高辛標記生長抑素cRNA探針獲得滿意結果，其探針濃度為0.5ng/μl。
必須強調的是，國內外實驗室都證明加雜交液的量要適當，以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多不僅造成浪費，而且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導致高背景染色等不良后果。
2．探針的長度一般應用于ISHH探針的最佳長度應在50～100個堿基之間。探針短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。據報告，長500個堿基的探針，其雜交時間約需20h左右。200～500個堿基的探針仍可應用，如超過500個堿基的探針則在雜交前最好用堿或水解酶進行水解，使其變成短的片段，達到實驗所需求的堿基數。
附：核酸探針水解法（以放射性標記探針為例）
（1）按下列比例混合
探針溶解于水 160μl無菌蒸餾水加入含標記探針沉淀物的Eppendrof管中
0.4mol/L NaHCO3 20μl
0.6mol/L Na2 CO3 20μl
混合后孵育于60℃水浴，其孵育時間由下式推算：
孵育時間= LO Lf /K×LO Lf
LO ：核酸探針原長度（Kb）
Lf ：核酸探水解后所需長度（Kb）
K：是一常數0.11Kb/min
?。?）在室溫中加入下列配方以終止水解
3mol/L 醋酸鈉 6.6μl(最終濃度0.1mol/L)
醋酸1.3μl(最終濃度0.5%)
（3）加下列配方沉淀探針
7mol/L 醋酸銨100μl
100%乙醇750μl
tRNA(10mg/ml) 2μl
置于―20℃2h后回暖至室溫，在14000rpm離心30min。
（4）小心將乙醇輕輕傾出，待試管內干燥后再用無菌蒸餾水稀釋到10ng/μl濃度。
?。?）應用放射性標記測定法測定其放射比活性（詳見第十九章?。缓笳{到5ng/μl濃度。
3．雜交的溫度和時間雜交的溫度也是雜交成功與否的一個重要環節 。在第十八章 概述中曾提到DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。能使50%的核苷酸變性解鏈所需的溫度，叫解鏈溫度或融解溫度（melting temperature, 簡稱Tm）。
原位雜交中，多數DNA探針需要的Tm是90℃，而RNA則需要95℃。這種高溫對保存組織形態完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。
因此，在雜交的程序中常規的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于雜交液中。McConaughy報告，反應液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用調節 鹽濃度的辦法來調節 Tm。Tm的計算公式在第十九章 有介紹，由公式的列出也表明了它與鹽的濃度、探針的長度、甲酰胺的百分比等諸多因素有關。
由于鹽和甲酰胺濃度的調節 等因素，實際采用的原位雜交的溫度在Tm-25℃左右，即比Tm減低25℃，大約在30～60℃之間，根據探針的種類不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在37～42℃左右，而DNA探針或細胞內靶核苷酸為DNA的。
則必須在80～95℃加熱使其變性，時間5～15min，（有作用報告在105℃微波爐加熱使之變性），然后在冰上擱置1min，使之迅速冷卻，以防復性，再置入盛有2×SSC的溫盒內，在37～42℃孵育雜交過夜。
雜交的時間如過短會造成雜交不完全，而過長則會增加非特異性染色。從理論上講，核苷酸雜交的有效反應時間在3h左右。Barns等（1987）報告用DNA探針雜交，其反應完成時間為2～4h。但為穩妥起見，一般將雜交反應時間定為16～20h，或為簡便起見雜交孵育過夜，從現有文獻報告看無不良結果。
當然，雜交反應的時間與核酸探針長度與組織通透性有關，在確定雜交反應時間應予考慮，并經反復實驗確定。
有作者主張雜交反應的孵育應在黑暗環境中進行，因為光線會促進甲酰胺的電離作用。
4．雜交嚴格度（Hybridization stringency）雜交條件的嚴格度（stringency）表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。錯配對(mismatch）雜交的穩定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。
所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應亦然。一般來說，低嚴格度（low stringency）雜交及沖洗條件在Tm -35℃至Tm 40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結合，其結果是導致非特異性雜交信號的產生。
中嚴格度，Tm -20℃至Tm-30℃的范圍。高嚴格度（high stringency）為Tm-10℃至Tm-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。在這種條件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩定的結合。
麥躍行裝用地高辛標記原位雜交技術檢測尖銳濕疣中人乳頭瘤病毒DNA型別，結果發現在嚴格條件下（Tm-12℃）各型病毒DNA的檢出率和陽性率明顯低于非嚴格條件下（Tm-35℃），其相差非常明顯（P<0.001）。
因為，在嚴格條件下只有同源性很強的DNA才被檢出，而在非嚴格條件下同源性較低的DNA序列也被檢出。因此，他建議對病毒DNA分型需在高嚴格條件下進行，而低嚴格條件則可用于對病毒感染進行篩選。
由于原位雜交技術多數是在Tm-25℃進行的，不屬于高嚴格范圍，無疑會產生非特異性結合導致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強雜交后處理洗滌的嚴格度使非特異性的雜交體減少。
由于RNA雜交的穩定性，應用cRNA探針進行細胞或組織的原位雜交時的雜交溫度比其它核酸探針要高10～15℃。實驗證明，cRNA產生的信號比雙鏈cDNA要強。單鏈的RNA探針其雜交信號大于雙鏈的cDNA的約8倍。
5．硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide）硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合（hydrate）作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度。
硫酸葡聚糖的主要作用是促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。這是應用硫酸葡聚糖于雜交液中的主要目的。
甲酰胺的主要作用在上節 已提及，在調節 雜交反應溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態結構。甲酰胺還可防止在低溫時非同源性片段的結合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩定的作用。
?。ㄋ模╇s交后處理（post hybridisation treatment）
雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學的實驗程序中，這也是一個重要的環節 。特別因為大多數的原位雜交實驗是在低嚴格度條件下進行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強了背景染色。
RNA探針雜交時產生的背景染色特別高，但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。
洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數和時間因核酸探針的類型和標記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注意的是在漂洗的過程中，切勿使切片干燥。
干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結合，從而增強了背景染色。放射性標記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法檢測背景染色（非特異性標記的多少）作為改善漂洗程序的指針。
在35 S標記的核酸探針在漂洗液中須加入14mmol/L的β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）或硫代硫酸鹽（thiosulphate），以防止35 S標記的核酸探針被氧化。總之，如何控制漂洗的嚴格度從而達到理想的信/噪比無既定方案可循，必須從反復的實踐中取得經驗。
?。ㄎ澹╋@示（Visualization）
顯示又可稱為檢測系統（Detection system）。根據核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統進行不同顯色處理（詳見本章 第二節 ）。
細胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進行半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計算機輔助的圖象分析檢測儀（computer assisted image analysis）檢測銀粒的數量和分布的差異。
非放射性核酸探針雜交的細胞或組織可利用酶檢測系統顯色，然后利用顯微分光光度計或圖像分析儀對不同類型和數量的核酸的顯色強度進行檢測。但利用ISHH做半定量測定必須注意嚴格控制實驗的同一條件，切片的厚度和核酸的保存量如取材固定的間隔時間等。如為放射自顯影，核乳膠膜的厚度與稀釋度等必須保持一致。
?。φ諏嶒灪虸SHH結果的判斷
和其它實驗方法一樣，并非ISHH的任何陽性信號都是特異性的，故必須同時有對照試驗以證明其特異性。對照試驗的設置須根據核酸探針和靶核苷酸的種類和現有的可能條件去選定，常用的對照試驗有下列幾種（表20-1）。
表20-1 ISHH對照試驗一覽表
| 核乳膠或非放射性檢測系統對照試驗 |
| Northern 或Southern印跡雜交法* |
| ISHH與免疫細胞化學結合* |
| 應用多種不同的核苷酸探針與同一靶核酸進行雜交 |
| 將cDNA或cRNA探針進行預雜交（吸收試驗）* |
| 與非特異性（載體）序列和不相關探針雜交（置換試驗） |
| 將切片應用RNA酶或DNA酶進行預處理后雜交* |
| 應用同義RNA探針（Sense probe）進行雜交* |
| 以不加核酸探針雜交液進行雜交（空白試驗） |
| 組織對照用已知確定為陽性或陰性組織進行ISHH對照 |
| 應用未標記探針做ISHH，進行對照 |
從理論上講，對照試驗設置愈多其靶核苷酸特異性確定愈可靠，但現實是不可能的。因此，在上述對照試驗中應任選設至少3～4種用以證實ISHH結果的可靠性。在上述試驗中，標明*者為比較可靠的對照試驗。
①Northern 和Southern印跡雜交法證明的方式和用Western印跡法檢測抗體（蛋白質）的特異性一樣，是比較可靠的。
②如果具備相當的免疫組化抗血清，可用結合的免疫組織化學和ISHH法從蛋白質（或多肽）水平和轉錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應mRNA共存于同一細胞中。
③預先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術證明丟失的是DNA或RNA。如同免疫組化的吸收試驗一樣，事先與特異性的cRNA或cDNA進行雜交。再進行ISHH，其結果應為陰性。
④由于同義RNA探針和組織內mRNA序列順序是相同的，應用其進行ISHH，結果應為陰性。檢測系統的對照如乳膠或酶顯色系統也應在無標記探針的情況下進行。
ISHH的最大優點是它的高度特異性，它可測定組織、培養的單個細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。應用高敏感度的放射性標記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mR－NA，其敏感度可達到20個mRNA拷貝/每個細胞。
由于雙鏈DNA的穩定性，在用ISHH定位DNA時很少發生丟失，降解。在靶核苷酸序列比較伸展的情況如染色體鋪片，長于2kb的探針可以應用。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。
正因為如此，對ISHH結果的解釋應持慎重態度，特別是前人未報告過的新發現。因為如前所述，影響ISHH實驗結果的因素太多，比如在外科或實驗取材后未及時的固定或冷凍可由于組織中mRNA的降解而導致假陰性結果。
另外，在各種類型核酸探針進入細胞、組織和各種器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各異。這些諸多因素都將影響ISHH的實驗結果。
第二節 cRNA探針在原位雜交組織化學（ISHH）中的應用
Angerer及其同事們首先應用RNA探針于原位雜交（見Cox et al 1984），核酸探針為單鏈的RNA分子，產生自具有質粒逆轉錄系統的cDNA克隆。由于它是單鏈的，不像雙鏈的DNA探針，在溶液中不會再退火（reanneal），因此，較大百分比的探針可參與雜交反應，較cDNA探針的信號強。
除此之外，在溶液中產生的cRNA-mRNA雜交體比相應的cDNA-mRNA雜交體穩定，但在原位雜交中是否如此尚未證明。cRNA探針不足之處在于有時比DNA探針粘性強（stickier）。
可與組織產生較高的非特異性結合，但此缺陷可在雜交后漂洗液中加用酶漂洗來解決。最近，Wolf等（1987）建議插入確定長度的寡核苷酸至載體內產生cRNA分子，這種cRBA分子稱為“寡核苷酸核酸探針”（oligoribo－probes）已被成功的用于原位雜交實驗。
一、同位素標記cRNA探針在ISHH中的應用
（一）組織切片的原位雜交細胞化學方法
?。?）組織準備：大鼠以10%水合氯醛（0.3ml/100g 體重），或1%戊巴比妥鈉約1ml（3～4mg/100g體重）腹腔內注射麻醉，用100ml生理鹽水沖洗和150ml 4%多聚甲醛主動脈灌注固定。固定半小時后，取出組織塊，置入4%多聚甲醛液中后固定4～6h，4℃。
如要取腦組織，可于灌注后置4℃冰箱內過夜，次晨取腦組織，后固定4℃4h左右。
?。?）組織切片/培養細胞在經過處理，抹以粘附劑的載片上，在43℃烤箱過夜。
（3）在PBS（0.1mol/l Ph7.2）中浸5～10min。
（4）浸于0.1mol/L甘氨酸―PBs 液內5min。
?。?）為增強組織通透性，將載片置于0.3%Triton X-100(在PBS內)10～15min。
（6）PBS洗3×5min。
（7）在蛋白激酶K（1μg/ml）溶于Tris HCl (0.1mol/L, pH8.0)和EDTA（50mmol/L,pH8）中37℃20min。也有用蛋白激酶K溶液，不加EDTA的。
?。?）浸入新鮮配制的4%多聚甲醛（在PBS0.1mokl/L,pH7.2）3min以終止消化作用和再固定。
?。?）浸入新鮮配制的含0.25%（V/V）三乙醇胺（0.1mol/l pH8.0）中，10min以達乙?；╝cetylate）的目的。
（10）預雜交：在50%（V/V）甲酰胺溶于4×SSC預熱37℃15～45min 。
?。?1）雜交：將載片上過量的甲酰胺液傾去，加20μl雜交混合液（含放射性同位素標記的探針量為5×103～ 106 cpm/每張載片）。覆以硅化的蓋玻片，置于盛有少量5×SSC的硬塑料盒內以保持濕度，42℃孵育12～18h。為使載片不致于浸泡于SSC溶液內，通常以二根玻管（或棒）扎成擔架狀，載片置于玻棒上，與鹽液不接觸，但可保持盒內空氣濕潤。
（12）雜交后漂洗
?、僖孕⑦m量4×SSC溶液，將載片一端斜插入溶液內，輕輕抖動以移除蓋玻片。
?、趯⑤d片置于有刻度的染色用小方玻缸內，加入42℃（預熱）4×SSC，3×20min。在漂洗過程中宜不斷振動，以增強漂洗效果。如設有調整鈕的振動臺更為理想。
③加20μlRNA酶溶液（20μg/ml）在NaCl(0.5mol/L)、Tris HCl (pH8.0)和EDTA（1mmol/L,pH8.0）消化未雜交探針，42℃30min（也有不加EDTA的）。
?、芤赃f減梯度鹽溶液SSC漂洗載片：2×SSC，0.1×SSC和0.05×SSC各30min 42℃。
⑤梯度酒精脫水：70%，90%，2×100%酒精含0.3mol/L乙酰胺，室溫，每次10min，空氣干燥后待進行放射自顯影。
?。?3）放射自顯影和復染
?、僭诎凳抑蓄A熱水浴至45℃，將分裝的核乳膠溶液小瓶置水浴中浸泡至少1h，同時預熱一電熱板至45℃。將雜交后漂洗過完全干燥的載片依次排列于玻片架上，有組織切片一面面向實驗者。在實驗的載玻片前放1～2張無切片的干凈玻片，作為測定核乳膠溶解度與浸片高度等的空白對照片。
浸泡（Dipping）過核乳膠膜的載片放入暗盒內，事先最好將暗盒準備好，為保持干燥，放入一包變色硅膠干燥劑（無水干燥劑為小塊藍色晶體，吸水后呈粉紅色，置烤箱中烘干待轉成藍色后可重復應用），預先備好封固暗盒用的膠帶備用。
?、诤巳槟z液，國外產品為ILFord K5乳膠液，國內核乳膠產品可自原子能研究所訂購。不論國產或進口乳膠，事先應（按說明需要濃度）稀釋分裝在10ml小瓶內，密封于暗盒內，4℃備用。反復的冷凍和融解核乳膠會增加背景染色。每一小瓶供一次性實驗應用。
為節 省核乳膠，切片宜貼附在靠近載片的一端。這樣，在浸泡時少量乳膠便可充分覆蓋切片。
③浸核乳膠（Dipping）：當一切準備工作就緒后，在暗室中（只留完全燈）先將載片置于電熱板上預熱1～2min。以空白載片浸入核乳膠液，取出后檢查核乳膠是否充分溶解，玻片上有無氣泡。然后正式進行切片浸入。浸核乳膠膜是一項需反復操練的技術。
以拇、食指夾住玻片一端，以垂直方向進入乳膠，進入的提出均應采取中速度，且速度應保持穩定，提出后可將玻片一端滴下的乳膠輕沾于吸水紙上，掌握好該技術，浸入形成的核乳膠膜厚度適當，均勻一致。依序放在預熱45℃的電熱板，傾斜度應一致。在45℃電熱板上干燥至少1～2h，在此期間應嚴格控制在黑暗中。
④裝入暗盒曝光：將載片架上已干燥覆有核乳膠的載片放入暗盒內，周圍用膠帶封固，以標簽寫明：樣品種類，實驗者姓名，曝光日期等放在4℃冷房或冰箱內。
曝光時間依同位素種類而異，32 P大約需5～7日，3 H需4周，但還要參考細胞內mRNA的含量而定，含量高者曝光時間宜短，反之宜適當延長?？筛鶕煌毓鈺r間的實驗結果予以調整。曝光時間長可增加信號，但也增加背景，反之，信號減弱，但背景亦低。
⑤顯影：取出切片中暗盒（注意：切勿啟封），放在室溫至少1h，使其回升到室溫。然后在暗室內（只留安全燈），將載片置入Kodax D19顯影液（預調溫至18～20℃）3min。水沖片刻后入Kodax F24固定劑內3min。上述溶液及水溫最好都保持在18～20℃。
突然改變溶液溫度會損壞精細的核乳膠膜。另外，在顯影和定影過程中不要振蕩溶液，因為，這時的乳膠還是處于膠狀結構，溶液振蕩的沖擊可使乳膠膜產生劃痕。
?、逈_洗，脫水和復染：用自來水（水沖力勿過猛）沖洗載片20min，如需要可用1%蘇木精復染，復染后自來水沖洗分化2min，梯度酒精脫水（70%，90%，100%）每次3min，二甲苯透明，DPX封片。
?。ǘ┡囵B細胞的原位雜交細胞化學方法
?。?）固定：通常將細胞培養在蓋玻片或塑料薄膜上，可將蓋玻片取出，傾去培養液，用4%多聚甲醛液固定2～4h后，依組織切片處理法進行ISHH實驗。也有在4%多聚甲醛室溫固定20min后，由低濃度30%，50%，70%酒精各3min ，保留在新鮮配制的70%酒精中，4℃，備用。
（2）重回到水：50%，30%酒精3min，無菌重蒸水2×3min，然后置入PBS含5mmol/l MgCl2 10min，室溫（配制法：200ml PBS, 1ml MgCl2 ）。
?。?）0.1mol/L甘氨酸/Tris pH7.4：室溫10min(0.1mol/L 甘氨酸，0.2mol/l Tris（配制法：1.5mg甘氨酸和20ml Tris，應用重蒸水制成200ml）。
以后步驟同（一）組織切片法。
二、生物素標記cRNA探針在原位雜交組織化學中的應用
?。ㄒ唬┕饷羯锼貥擞沜RNA探針的應用
以線性質粒DNA為模板合成未加標記物的cRNA探針，使其最終濃度為0.5～1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再與等體積的光敏生物素（1μg/μl）混合。在150瓦鹵素燈下，距離光源20cm處照射30min。
用仲丁醇抽提游離生物素，再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探針，將其溶于適量的滅菌雙蒸水，用紫外分光光度計測探針的光密度（詳第十九章 ），其最佳工作濃度為2μg/ml。
切片的制作、預處理、預雜交、雜交和雜交后沖洗的方法同概述中基本方法一節 。
光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序：
（1）石蠟切片脫蠟入水后，置0.1mol/l PBS pH7.2沖洗5min；冰凍切片直接入PBS沖洗5min。
?。?）0.1mol/l 甘氨酸PBS沖洗5min。
?。?）0.4%Trition X-100 PBS 沖洗15min。
?。?）蛋白酶K1μg/ml（0.1mol/l Tris HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配）37℃保溫30min。
?。?）4%多聚甲醛PBS固定5min。
（6）0.1mol/l PBS沖洗2×3min。
（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。
?。?）2×SSC沖洗10min（1×SSC：0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 檸檬酸鈉）。
?。?）取10μl含相應探針的雜交液滴于標本上，如果是cDNA探針則用前將探針于95℃水浴中保溫10min，馬上放入冰浴中冷卻，然后再用。
?。?0）蓋上22×22mm的硅化蓋片或合適大小的蠟膜，入溫盒43℃保溫12～16h。
（11）4×SSC洗脫蓋片，并在同一液中37℃漂洗10～30min。
?。?2）2×SSC（含20μg/mlRNaseA, 適于RNA探針）沖洗30min，37℃。
?。?3）1×SSC，0.1×SSC,37℃各漂洗10～30min。
?。?4）0.05mol/l PBS 沖洗4×5min。
?。?5）3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS配）37℃保溫30min。
?。?6）Avidin AKP(堿性磷酸酶)（1：500～1：100，0.4%Triton X-100 PBS配）室溫1～3h。
（17）0.05mol/l PBS沖洗4×5min。
（18）TSM1 沖洗2×5min。
?。?9）TSM2 沖洗2×5min。
?。?0）硝基四氮唑藍（NBT）0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）0.2mg/ml混合液顯色，室溫，暗處3h。
?。?1）20mmol/l EDTA,pH8.0終止顯色。
?。?2）甘油明膠直接封片。
結果：雜交陽性部位著藍黑色。
組織處理及預雜交所用器皿需高溫消毒，實驗者需戴手套。
（二）酶促生物素標記cRNA探針的應用
基本方法和放射性標記cRNA探針同，所不同的是探針濃度為2.5μg/μl。顯示探針反應步驟如下。
（1）用PBS沖洗粘附有切片的載片2×3min。根據情況也可用漂洗法。
?。?）將載片浸入0.3%H2 O2 在PBS或甲醇內30min以封閉內源性過氧化物酶。
?。?）PBS沖洗2×3min，用吸水紙拭干切片周圍的水份，加入小鼠抗生物素血清1：100和PBS含正常羊血清（1：30），室溫1h，或4℃過夜。
?。?）PBS徹底沖洗。
（5）載片加生物素化抗小鼠IgG（1：100）30min室溫。
（6）PBS徹底沖洗。
?。?）應用ABC復合物與等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合孵育1h，室溫。
?。?）PBS徹底沖洗。
?。?）將切片覆以新鮮配制的0.025%DAB溶液，0.02%H2 O2 ,孵育3～15min。
（10）水洗，復染，脫水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。如需要可用銀染，多層ABC或PAP法加強染色效果。
三、地高辛標記cRNA探針的應用
?。ㄒ唬┗驹?/span>
地高辛（Digoxigenin 簡寫Digo-）又稱異羥基洋地黃毒甙配基，這種類固醇半抗原僅限于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物如人體中的性激素等無交叉反應，地高辛配基標記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成digoxigenin 11-dUTP。
通過隨機引物或缺口翻譯法（多用隨機引物法），將dig-11-dUTP與探針的核酸分子相連，構成Dig-配基標記的核酸探針。
將這種標記的探針與組織、細胞或染色體原位核酸分子之間的同源序列在一定條件下互補雜交，然后用偶聯有酶或熒光素的羊抗高地辛抗體Tab（抗原結合片段）結合物作為酶標或熒光標記，再分別用顯色底物使雜交部位顯色或產生熒光以達到檢測目的，其反應過程見圖20-3。
圖20-3 地高辛標記的探針檢測酶聯免疫反應
常用的免疫酶學檢測方法有兩類：一是Dig HRP（辣根過氧化物酶）檢測體系，以DAB（四氫氯化二氨基聯苯胺）/H2 O2 為底物，結果為棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2 O2 為底物，結果為藍色。另一是Dig AKP檢測體系：以BCIP/NBT為底物，結果為藍紫色沉淀。
與免疫細胞化學方法相似，如應用酶促反應會較單一信號的標記物如熒光素具有更高的靈敏度。同樣是酶促化學反應，AKP靈敏度和分辨率較HRP高約10倍左右，但HRP的優點為價廉、穩定。
應用地高辛標記的核酸探針也較穩定，據報告在-20℃貯存可達2年，隨時要取用，不像放射性標記探針有半衰期所致的時間限制。但在現實應用中，仍喜歡采用新鮮的地高辛配基標記3～6個月以內的核酸探針。
為節省核酸探針的用量，凡使用過的含有探針的雜交液也可反復多次使用，特別是對于已知的重復性實驗。對于細胞或組織內未知mRNA的檢測，仍宜采用未使用過的探針雜交液為佳。
與放射性標記相比，地高辛標記探針具有非放射性探針的優點，對人體無害，不受半衰期限制，探針可長期保存。與生物素標記探針相比，地高辛探針不受組織、細胞中內源性生物素的干擾，敏感性高。
由于地高辛具有靈敏度及分辨率高，反應產物顏色鮮艷，反差好，背景染色低，制備探針可較長期保存，對人體無害等優點，已日益顯示出它的優越性和廣泛的應用前景。
它不僅可應用于原位雜交細胞化學，還可應用于Southern印跡雜交法檢測特定基因組序列，進行RFLP分析用于基因診斷，菌落原位雜交，噬菌斑原位雜交，固定細胞及中期染色體原位雜交以及生物體液中，組織中病毒DNA序列的檢測。這一技術還被應用于檢測DNA標記物及測序，對人類染色體連鎖圖譜進行構建和基因圖譜分析。
?。ǘ┗静僮鞑襟E
組織處理及預雜交等步驟與本章 中敘述的放射性同位素標記cRNA探針相同，但由于地高辛標記cRNA探針在原位雜交細胞化學中已愈來愈得到廣泛的應用，我們在基本方法中仍較詳細的敘述其操作過程。
1．組織前處理在組織制片中以冷凍切片（厚10～30μm）最佳。切片貼在預先清潔，高溫處理并涂以粘附劑載玻片上，先在37℃預干燥4h，然后置于37℃烤箱中過夜。經過上述處理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存數月之久，有報告可保存數年之久的。
但仍以新鮮制片為好。如為石蠟包埋切片，應脫蠟經梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在細胞內mRNA含量高時應用二甲苯脫蠟后仍能顯示。經水洗后入37℃烤箱4h或過夜，然后進行雜交前處理。
在烘烤及低溫保存時，為防塵埃及空氣中RNA酶的污染，宜用錫箔紙（foilpaper）包被，內加少許干燥劑（變色硅膠）。
下列步驟所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。
?。?）PBS洗2×3min。
（2）選擇少數幾張切片作為“RNA酶對照片”。
其它切片暫放于PBs 內。
RNA酶對照片處理方法：加RNA酶（100μg/ml）在預熱37℃的溶液內。放在潮濕的盛有少許2×SSC塑料盒或蒸發皿內。在每張切片上覆以過量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC沖洗，2×3min，然后與其它保存在PBS的切片一起進行下列處理。
?。?）蛋白酶K消化：將組織切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，內含蛋白酶K1μg/ml，孵育15～20min。消化時間應根據組織的種類，厚度反復試驗調整。時間過短探針不易進入，過長影響細胞或組織的形態結構。
?。?）0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min終止蛋白激酶K反應。0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。
（5）在4%多聚甲醛/PBS3min。
（6）以PBs 漂洗2×3min。
（7）浸入新鮮配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制）10min，以封閉非特異性結合部位。
?。?）2×SSC漂洗15min。
2．雜交以含cRNA探針（0.5ng/ml）的雜交液，按每張切片10～2μl的量覆蓋切片。地高辛配基標記的cRNA核酸探針保存濃度為2.5ng/ml，用前稀釋備用。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟膜，置于盛有少量2×SSC溫盒內在42℃，16～18h或過夜。
3．顯示
?。?）用緩沖液1沖洗雜交后的載片2×3min。
?。?）在緩沖液1中10min，室溫以封閉非特異性結合部位。
（3）拭干切片周圍的載片，注意保持切片濕潤。加數滴抗地高辛抗血清（工作濃度1：500，以緩沖液1稀釋），孵育2h，室溫。
?。?）緩沖液1漂洗3×3min。
?。?）浸入緩沖液210min室溫。
?。?）浸入底物中孵育10～30min（或更長時間，視需要而定），底物內含顯色BCIP/NBT，室溫。最好用錫箔紙包裹反應盒，使顯色在黑暗中進行。定期取出切片在顯微鏡下檢測反應強度。根據反應強度決定延長或終止反應。反應顏色為紫藍色。
?。?）將切片浸入緩沖液3以終止反應。
?。?）復染，可用1%伊紅、1%蘇木精、1%亮綠或5%的焦寧（又稱派咯寧丫）（pyronin 丫）10～30s。
?。?）流水洗5～10min，直至水無色為止。
（10）在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在蓋片四周封固。為去除水份，在封固前可進行梯度酒精脫水，透明，DPX封固，但每步時間僅需幾秒鐘，時間過長易致褪色。
幾點說明
①緩沖液1，2，3配制法見附錄。緩沖液1中BSA用量大，價貴，如無法負擔可略去。
?、谇衅幚磉^程可采取漂浮法或載片染色法，載片染色適用于切片數數量較少時，可用液體覆蓋于切片表面進行孵育，漂洗在燒杯內進行。如切片多，可將載片置于方形的染色缸（staining jar）內，將沖洗液加入缸內，如有振蕩器在漂洗中稍加震蕩更有助于減低背景染色。
漂浮法適用于切片數量大量，將切片置于凹形碟內，或染色缸內。漂浮法的優點是節約試劑用量，切片兩面均可接觸反應液，有利于信號的增強。
?、墼诘孜镏蟹跤龝r間過長會產生弱強的非特異性染色，有時甚至誤為陽性反應。解決方法一是設置對照片，二是對非特異性染色加以區別。非特異性染色與特異性染色的主要區別點在于后者有結構性定位，而前者系無結構性定位，常在切片邊緣或細胞密集處呈現較強的顏色反應。
?、茉诮M織前處理中應嚴格注意控制RNA酶的污染，包括戴手套、器皿消毒等。另外，和免疫細胞化學一樣，自始至終應保持切片的濕潤，勿令其干燥。
[NextPage]
第三節 DNA及寡核苷酸探針在原位雜交組織化學中的應用
一、DNA探針的應用
雖然一般認為DNA探針敏感度不如cRNA探針，但在病毒的檢測等領域中DNA探針仍得到廣泛的應用。
在原位雜交細胞化學的操作步驟方面與cRNA探針基本相同，所不同的是：
（1）雜交時需先在高溫80～95℃短時處理，使DNA探針及細胞內靶DNA變性，解離成單鏈，迅置于冰上冷卻。然后置于37℃～42℃雜交過夜。
（2）RNA酶的溶液的沖洗不能減低背景，因此，在操作步驟中省略此步。
?。ㄒ唬┑馗咝?堿性磷酸酶（Dig -AKP）標記DNA探針在石蠟包埋切片檢測病毒DNA中的應用
1．組織前處理
?。?）固定：組織以10%中性福爾馬林液或Bouins液固定，常規石蠟包埋，切片厚4～6μm，粘附于涂有粘附劑的玻片上，入烤箱60～80℃6～8h，使切片更緊貼玻片。
?。?）脫蠟：二甲苯10min ×2，自100%乙醇，90%，70%，50%，30%各5min。入PBS（含5mmol/l MgCl2 ,pH7.3～7.4）10min×2。入0.2n HCl 20min以進一步去除蛋白。
?。?）50℃2×SSC，含5mmol/l EDTA溶液中30min。
（4）蛋白酶K（1μg/ml溶于0.1mol/l PBS中，）37℃20～25min。
?。?）0.2mol/l 甘氨酸液：室溫10min，中止蛋白酶反應。
（6）4%多聚甲醛（PBS新鮮配制）：室溫20min。
?。?）PBS/5mmol/l MgCl2 漂洗10min×2。
（8）脫水，自低濃度到高濃度，無水乙醇各3min，空氣干燥。
2．預雜交封閉非特異性雜交位點，20μl/每張切片，42℃水浴半小時。
3．雜交10～20μl/每張切片，加蓋硅化蓋玻片，將切片置于95℃min，使探針及病毒DNA變性，然后迅速置于冰上1min（也有報告用乙醇使之冷卻的），然后將切片置于盛有2×SSC濕盒內，42℃過夜（16～18h）。
4．雜交后漂洗
（1）2×SSC液內振動移除蓋片。
?。?）2×SSc 55℃10min×2。
（3）0.5×SSc 55℃5min×2。
?。?）緩沖液II（含0.5%封阻試劑，用緩沖液I溶解）37℃30min。
?。?）緩沖液I（10mmol/l Tris HCl, 15.0mmol/L NaCl pH7.5）15min，室溫。
?。?）酶標地高辛抗體（1：5000，應用緩沖液I稀釋）37℃30min。
（7）緩沖液i 15min×2室溫。
?。?）緩沖液III（100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2 ,pH9.5）室溫2min。
5．顯色
（1）顯色液配制：緩沖液III：1ml中加入4.5μl四氮唑藍（NBT），3.5μl X-磷酸鹽（5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽（BCIP配成））。30μl/每張切片，置暗處顯色30min到2h。定時抽查切片，鏡檢其顯色情況。
?。?）緩沖IV（10mmol/l Tris HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0）10min終止反應，甲綠復染5min，二甲苯透明，DPX封固，鏡檢。
?。ǘ晒鈽擞汥NA探針的應用
1．概述在原位雜交細胞化學中熒光標記DNA探針（Fluorescence in situ DNA hybridisa－tion , FISH）的應用在細胞培養和染色體鋪片（見二十一章?。┲休^為廣泛。FISH屬于非放射性標記，其優點在于簡便，快速，其敏感性可與放射性同位素標記核酸探針相等。不少實驗室報告應用FISH（2～5kbp探針）可成功地達到單個拷貝（copy）的特異性定位。
2．熒光標記DNA探針應用于ISHH中的基本原則（Barbara Traok和Dan Pinkel 1990）
?。?）首先應使組織或染色體中靶核苷酸高溫加熱變性解離為單鏈DNA，化學性標記的DNA探針除外。
?。?）雜交：一般在37℃進行，探針稀釋濃度在2ng/μl，染色體鋪片探針濃度在0.4ng/μl,雜交液2～3μl/每cm2 蓋片，每張蓋片大約1.8cm2 ，約需10μl雜交液。有實驗室報告，如每張蓋片（溫度為室溫）加入雜交液將會降低雜交溫度所需要的37℃，因此，建議對蓋片應用前在37℃進行預熱。
?。?）用免疫細胞化學或組織化學方法顯示熒光標記。自80年代以來，熒光素標記檢測系統日益增加。包括：
①生物素標記探針與熒光素標記的抗生物素（avidin）或抗生物素抗體。
②氨乙?；鶡晒猓╝minoacetylfluroence,AAF）-改良探針（modified probe），與抗AAF抗血清。
③磺酸（sulfonatc）改良探針，以抗磺酸抗血清檢測（Organic Ltd, Yavene, Israel和TMc Bioproducts Rockland ME可提供此藥盒）。
④汞標記探針（mercurated probe），以硫氫基（sulf hydryl）與熒光標記物或-半抗原相結合，再以抗半抗原抗血清檢測。
⑤地高辛標記探針，以地高辛抗血清檢測（Boehringer Manubeim Inc, Mannhein, FRG可提供此藥盒）。在上述各例中，為簡便可采用直接法，為提高敏感度可采用間接法。
生物素和地高辛用缺口平移法或隨機引物法進行標記，以用后者為多。氨乙酰熒光素，磺酸和汞的核苷酸探針標記利用簡單的化學反應。產生熒光的物質各有不同，常用的有異硫氰酸熒光素（FITC），也有應用德克薩斯紅（texaored）獲得滿意效果的。
但藻紅素（Phycoerythrin）應用效果較差，可能由于分子大的緣故?？赏瑫r應用AAF和生物素標記系統及汞與生物素系統分別應用不同的熒光素去標記兩條DNA進行雙重染色。
3．基本操作方法
?。?）玻片準備：細胞用甲醇：醋酸（3：1）固定，滴在玻片上可保存在-20℃，如將此載片烘烤于65℃數小時，將會導致樣品的人工老化。應用相差顯微鏡在低倍下定位最佳區域，或用嘴輕吹氣的方法可以看見浮動的細胞。在玻片背面圈出蓋片應覆蓋的區域。
（2）RNA酶處理：加50μlRNA酶溶液，蓋以蓋玻片，放在濕盒內（2×SSC）37℃1h。應用2×SSC漂洗2×3min，室溫，梯度酒精脫水（70%，90%，100%），在空氣中干燥。
?。?）蛋白酶K和多聚甲醛處理：對單個拷貝雜交，蛋白酶K溶液（0.3～0.6μg/ml，在20mmol/l Tris HCl, pH7.5, 2mmol/L CaCl2 ）在37℃孵育2h。此法對甲醇-醋酸固定的淋巴細胞效果特佳，但這種濃度的蛋白酶K溶液對未事先經多聚甲醛固定的染色體制片可在靶DNA變性步驟中完全破壞。
因此，需根據細胞類型調整溶液的濃度和孵育時間。蛋白酶K消化后，以2×SSC，在室溫漂洗2min×3，再固定于4%多聚甲醛溶液中，室溫10min。2×SSC洗2min×3。
?。?）靶DNA變性：將載片浸入70℃變性溶液（70%甲酰胺，2×SSC）2min。新鮮的變性溶液需每周配制，貯存于4℃冰箱中備用。一張處于室溫的載片放入50ml的染色缸（coplin jar）內，將會使溶液溫度減低約1℃，因此，每次應加入少量玻片，以免影響溶液的溫度致變性不完全。
冷卻變性處理后的載片可放在冰上或浸入70%酒精溶液1min。漂洗加震動以終止反應和徹底去除變性溶液。然后經梯度酒精脫水（80%，90%，100%），空氣干燥。
?。?）雜交液的準備
MM1 甲酰胺5.0ml
硫酸葡聚糖1.0g
20×SSC 1.0ml
?。ɑ?0%硫酸葡聚糖）2.0ml
MM2 甲酰胺 5.5ml
硫酸葡聚糖1 .0gm
20×SSC 0.5ml
首先將溶液在70℃加溫，以溶解硫酸葡聚糖，冷卻后調整pH至7.0,容量加至70ml。這容量是最后應用的雜交混合液的70%，其余的30%為核酸探針和水（如果需要的話）。MM1 給預雜交混合液是：50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖2×SSC。Trask發現MM2 效果較MM1 好，DNA的Tm比MM1 低-8℃。在2×2cm區域雜交混合液應為：MM1 7μl，DNA探針（保存液為500μg～10mg/ml）1μl，加探針混合液2μl，總量為10μl。
（6）雜交：每張蓋玻片加10μl雜交混合液，注意移除氣泡，可在蓋片四周加橡皮泥封固，在37℃濕盒中過夜。
?。?）漂洗：從溫箱中取出后，以鑷子移除橡皮泥，從現在起注意勿使載片干燥。否則鹽的晶體將產生非特異性背景染色，漂洗應用2×SSC（pH7）在45℃3min×3。不時震動以助徹底漂洗，蓋玻片將在漂洗中自然移除。然后再在2×SSC，45℃，2min×3。保存載片于PBS溶液內。
（8）熒光顯示：
?、偕锼貥擞汥NA探針的熒光顯示。
1）應用PBS含5%無脂干奶（5μl每張蓋片），也可用1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS覆蓋孵育5min室溫，以封閉非特異性結合部位。
2）移除多余液體，加抗生素-FITC（5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA，5μl/cm2 ）。在濕盒中，室溫孵育20min?？股锼?FITC在此應用是過量的，因此，可回收貯存4℃再次應用，其保存時間可達數周。反應見圖20-4A直接法。
3）漂洗：PBs 2min×3，45℃。
4）如需放大（amplification）,即提高其敏感度，可按圖20-4B間接法加生物素化羊抗抗生物素抗血清（biotinylated goat antivaidin antibody）30min室溫。傾去加另一層抗生物素-FITC抗血清孵育20min，重復上述1）～3）。
?、贏AF標記核酸探針的熒光顯示
1）封閉非特異性結合部位：從PBS中取出載片，吸干多余液體，加PBS-0.1%吐溫（Tween）含2%正常羊血清（NGS）（5μl/每cm2 蓋玻片）。使載片停留在室溫5min。
2）傾去多余液體，加抗-AAF抗血清1：750，PBS-Tween NGS溶液（如上i）5μl/cm2 蓋玻片。室溫37℃。孵育30min.
3）漂洗：PBS-0.1%Tween室溫5min×3，間歇性振蕩。
4）羊抗小鼠IgG-FITC孵育，1：300～1：1000在PBS-0.1%Tween含2%NGS，37℃孵育30min，如3）應用PBS-0.1%Tween 漂洗5min×3。
4．熒光標記DNA探針在細胞核混懸液雜交中的應用
?。?）細胞核的分離：將培養的細胞制成細胞混懸液，或以胰蛋白酶消化法于培養蓋上收集培養細胞。應用MgSO4 染色分離方法分離細胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章?。＜毎鞈乙簼舛葹?×106 /ml。利用RNA酶消化后，使核從細胞分離，細胞核混懸液濃度為4～5×106 細胞核/ml。
?。?）細胞固定和酸的處理：在5ml試管內加冷的100%酒精不斷旋轉以達到滿意的固定。在冰上停留10min。在4℃離心（×150g）10min。重復加三次冷的100%酒精入試管內，離心，傾去。置于冰上10min，再離心。然后加入相當核懸液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室溫停留10min。
加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO4 , 5mmol/L HEPES pH8.0）。再離心，重復IBM漂洗（這時細胞核可在不染色情況下，以熒光顯微鏡觀察）后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，繼之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO4 。
在室溫靜置站立10min。傾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，離心，使細胞核混懸液最終濃度為108 /ml，（可用IBM-Triton X-100稀釋約50倍，在血球計數器計數），混懸液鏡檢應含單個，完整的細胞核。
?。?）細胞核混懸液雜交
?、倥渲齐s交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH調至7.0。此原液（stock solution）可貯存在4℃冰箱內。應用時加1份10mg/ml鯡魚精子DNA（herring sperm DNA）。
②混合1μl的細胞核混懸液（108 /ml）與18μl的雜交混合液，充分混勻。將此19μl混合液移入1.5ml容積的Eppendorf 管中（核含量約為105 ）。
?、奂尤?00ng/每管的AAF標記DNA探針（如為生物素標記DNA探針濃度為20～40ng/每管）。
?、苤?0℃10min使DNA探針和核DNA變性。
⑤和組織切片與DNA探針雜交方法相較，不同的是在加熱變性后切勿置冰上迅速冷卻以終止反應，而應迅速轉入37℃孵育過夜。
（4）雜交后漂洗
①在每管中加入1.25ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0），在42℃靜置10～15min。偶爾旋轉以助混勻。冷卻至室溫。加100μl經dimethylsuberimidate(DEMS)處理的血細胞（107 /ml）混勻，離心，室溫，10min，輕彈試管使沉淀的小塊散開，加入1.25ml 2×SSC(pH7.0)，42℃，繼之，靜置于室溫10～15min，如前離心，再加1.25ml IBM-Triton X-100,室溫靜置5min，離心。
注：DEMS處理紅細胞方法：經漂洗并離心去除白細胞和血清的紅細胞在鹽液如PBS中，細胞含量為108 /ml，以K2 CO3 和DEMS溶液處理3次，第1次：K2 CO3 為20mmol/L,DEMS為3mmol/L，以后2次：K2 CO3 依然為20mmol/L，而DEMS為10mmol/L。
在應用前將K2 CO3 和DEMS液混合加入紅細胞混懸液中。在最后2次漂洗液中，應用100mmol/l K2 CO3 將pH調至9～10。在25℃，15min后，加入50μl，100mmol/l 的檸檬酸（citric acid）/每ml細胞混懸液的濃度以達固定紅細胞的目的。
固定的紅細胞離心傾去上清液后，用2×SSC稀釋到108 /ml，加0.1%疊氮鈉可在4℃保存至少1年。
?。?）AFF標記的熒光顯示：加200μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS），輕輕振蕩混勻，室溫靜置10min，加20μl 1：100的單克隆抗AFF抗體，37℃孵育45min，加1.25ml的PBS-Tween，室溫靜置10min，加20間歇性振蕩，離心，傾去上清液，加200μlPBS含0.05%Tween 2%NGS,振蕩，室溫靜置10min，加20μl的羊抗小鼠FITC熒光標記抗血清，稀釋度1：100～1：300。孵育于37℃45min，加1.25ml PBS Tween,室溫靜置10min，離心，傾去上清液。
?。?）生物素標記探針的熒光顯示：加200μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室溫靜置10min后，加20μl抗生物素標記FITC抗血清15μg/ml，孵育在37℃30min，以1.5ml 4×SSc 0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25ml IBm Triton X-100,室溫靜置10～15min，間歇振蕩、離心。
?。?）熒光顯微鏡觀察：將細胞核混懸液稀釋于250μl的IBM-Trion X-100中，輕加振蕩混勻。為抗熒光褪色可加等量的抗褪色溶液至載片上的細胞核涂片上，選擇適當的激發波長觀察。
（8）流式細胞計：將750μl的細胞核混懸液通過流式細胞儀（Flow cytometry, FCM），DEMS處理過的紅細胞作為對照（Df 530/30nm, Omega ?Optical Inc, Brattleboro, VT）。詳細操作見第十章 。
二、寡核苷酸探針的應用
寡核苷酸探針的優點在于它能根據需要人工用DNA合成儀合成，其長度及分子大小比較一致，可以控制。其長度一般較克隆的DNA片段短。目前，寡核苷酸探針已能成功的為放射性同位素、熒光素、生物素和地高辛所標記，并成功地運用于培養細胞、組織切片和染色體鋪片等的原位雜交中。
雖然有些科技工作者認為其敏感度不如來自質粒擴增的cRNA或DNA探針，但由于探針制備簡便再加之于近年非放射性標記的成功，寡核苷酸探針在生物基礎醫學及臨床學科領域中得到較為廣泛的應用。
在原位雜交組織化學中應用寡核苷酸探針，其基本操作要點是相同的，如雜交溫度在Tm -25℃，雜交孵育時間以過夜（16h左右）為佳。應用寡核苷酸探針在原位雜交組織化學技術中的成功與否主要決定于探針的設計，使有效配對率增加而錯配（mismatch）減少。
?。ㄒ唬┑馗咝翗擞浌押塑账崽结樀膽?/span>
1．組織處理
?。?）冷凍切片：厚10～20μm，貼于事先經清潔處理及涂有粘附劑的切片上。切片保存于-80℃，在應用于雜交實驗前，使迅速回升到室溫，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc 10min。
?。?）石蠟包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蠟，以100%乙醇10min ×2，空氣干燥10min，從高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/每個濃度。PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。
?。?）離心細胞涂片：將細胞先以4%多聚甲醛固定，應用離心沉淀法，將沉淀物涂于有粘附劑的載片上，應用PBS（含5mmol/l MgCl2 ）5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。在0.2mol/l Tris HCl 含（0.1mol/L甘氨酸）pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。
2．探針準備35pmol的寡核苷酸（oligo -）探針，3’ 終末標記以地高辛-11dUTP。
3．預雜交和雜交加約300μl預雜交液（配制法見附錄）在每張載片上，室溫孵育1h。如為鯡魚精子DNA，在應用前須在沸水浴中加熱10min，而對酵母tRNA可不用加熱變性。
（1）應用預雜交液稀釋地高辛標記的Oligo-探針，探針理想工作濃度根據于待測核苷酸含量和實踐的結果。如對于檢測大鼠垂體的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA的Oligo 探針，其理想工作濃度為342ng/ml(0.342ng/μl)。
?。?）預雜交后以2×SSC漂洗，以吸水紙拭干切片周圍水份，加30μl雜交液在切片上，加硅化蓋玻片，在37℃過夜。如探針大于36堿基則雜交溫度為42℃。次日室溫2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室溫），0.5×SSc 37℃漂洗半小時，0.5×SSC室溫漂洗半小時。
4．地高辛顯示（同前）。
（二）同位素標記寡核苷酸探針的應用
1．組織處理大鼠應用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經心臟灌注4%多聚甲醛-磷酸緩沖液中，約2h后（也可置于4℃冰箱過夜）取腦浸于同樣固定液中加10%蔗糖溶液過夜，4℃。次日恒冷箱切片（-14℃），厚14μm左右，貼于有粘附劑的載片上，37℃或室溫干燥以增加切片的粘附性。
2．雜交前處理同本章 第二節 放射性標記cRNA探針一節 。
3．雜交37℃過夜，余細胞同前。
4．雜交后漂洗2×SSc 5min×3，1×SSc 1min室溫，0.5×SSc 55℃15min×2，室溫漂洗于0.5×SSc 3min×2。梯度酒精脫水，切片室溫干燥。
5．浸核乳膠切片浸入核乳膠，黑盒封閉，在4℃曝光2～3周（視同位素種類），顯影，復染，觀察。
[NextPage]
第四節 原位雜交組織化學與免疫細胞化學結合法
原位雜交組化（ISHH）與免疫組織化學（IHC）結合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或兩個相鄰切片進行染色，這樣就可以同一細胞中顯示出某種mRNA和相應的蛋白、多肽或其它抗原，從而可更好地了解某一基因的轉錄和蛋白、多肽合成的動力學。
ISHH與IHC結合法可以在相鄰切片上分別進行ISHH和IHC染色，也可先后在同一切片上進行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都獲得理想的結果，易成功，但易產生空間誤差和樣本誤差。在同一切片上進行結合法可克服這些誤差，但第一次染色總要或多或少地影響第二次染色，使第二次染色不十分理想。
由于m RNA易被染色過程中污染有少量RNase的液體所降解，因而在實踐中往往首先進行原位雜交組化染色，這種次序使結合法易成功。但在操作方法中應注意減少生物活性肽或蛋白的丟失，如在雜交后沖洗中適當減低漂洗溫度。
一、同位素原位雜交組化與免疫組化PAP法的聯合程序
?。?）切片入PBS沖洗5min，最好是將切片漂洗于滅菌器皿中。
?。?）0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。
（3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。
?。?）1μg/ml蛋白酶K，37℃保溫30min。
?。?）4%多聚甲醛PBS固定5min 。
?。?）PBS沖洗2×3min。
（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。
（8）2×SSC沖洗10min。
?。?）雜交：如是cDNA探針用前需進行變性處理，載片法時將切片在空氣中晾干，加含探針的雜交液10μl于切片上，蓋上22×22mm的硅化蓋片或相當大小看蠟膜，3 H標記探針每10μl雜交液含1×105 cpm探針，32 P或35 S標記探針每10μl雜交液含5×105 cpm探針；如是漂浮切片，則用滅菌吸水紙將切片水份盡量吸干，然后入雜交液，探針濃度和載片法一樣。入雜交液后43℃保溫12～16h。
?。?0）4×SSc 37℃沖洗10～30min。
?。?1）2×SSC（如為RNA探針則含20μg/ml RNase）37℃沖洗30min。
?。?2）1×SSC和0.1×SSc 37℃分別沖洗30min。
?。?3）PBS沖洗2×5min。（轉錄ISHH）
?。?4）0.5%H2 O2 PBS室溫30min。
?。?5）1%BSA 37℃，30min 。
（16）第一抗體，4℃孵育16～24h。
?。?7）PBS沖洗4×5min。
?。?8）第二抗體37℃，1h。
（19）PBS沖洗3×5min。
?。?0）兔PAp 37℃，1h 。
?。?1）PBS沖洗3×5min。
?。?2）DAB顯色液5～10min（DAB顯色液：0.05%DAB + 0.03% H2 O2 PBS液配）。
（23）PBS沖洗3×5min。如是漂浮切片則將其貼于涂有粘附劑的載片上，晾干。
?。?4）切片入70%，85%，95%和2個100%酒精脫水，空氣干燥。
?。?5）在暗室涂布乳膠（乳膠配制：乳膠原液：0.6mol/L醋酸胺=1：1），晾干，裝入自顯影暗盒。
?。?6）4℃曝光：3 H標記探針4～8周，35 S標記探針1～4周，32 P標記探針7～10天。
?。?7）D196 顯影液，20℃顯影5～10min。
（28）自來水沖洗數秒。
?。?9）F5 堅膜定影液10min。
?。?0）自來水沖洗15min。
（31）切片溫箱烤干，脫水，透明，封片。
結果：蛋白或多肽免疫反應陽性細胞為棕色胞質，而其相應mRNA為黑色銀顆粒聚集。
二、非同位素原位雜交組化與免疫組化聯合法
非同位素標記物很多例如：生物素（biotin），地高辛（Digoxigenin），汞（mercury），溴（bromine）和堿性磷酸酶等，其中目前應用最多的是生物素和地高辛。將此法與免疫組化PAP法或ABC法聯合使用，能成功地顯示一些神經肽mRNA和神經肽的共存與共同分布。
向正華等發現堿性磷酸酶抗地高辛抗體是經木瓜蛋白酶處理的，只有抗體的Fab段沒有Fc段，而免疫細胞化學（Immunocytochemistry,ICC）所應用的抗體既有Fab段，又有Fc段。
由于抗體的這一特性可在ISHH和ICC抗體孵育時將檢測核酸的抗地高辛抗體Fab段與檢測蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片，這樣可明顯縮短ISHH和ICC結合法的實驗周期，同時還可以減少實驗過程中對ICC檢測的蛋白、多肽的損害，使結合法易成功。
為什么兩種抗體可同時混合孵育切片，這是因為抗地高辛抗體只有Fab段，而沒有Fc段。
我們知道抗體的抗原決定簇在Fc段，因此第二抗體與第一抗體的結合是第二抗體的Fab與第一抗體的Fc，所以第一抗體如果只有Fab段沒有Fc段，那么第二抗體就無法與一抗結合。因此實驗中將二種抗體混合孵育切片而不會產生交叉結合。
此種ISHH與ICC聯合法穩定，實驗周期短，藍色與棕色反差強，是目前較好的ISHH與ICC結合法。詳細程序如下：
?。?）將切片漂浮于能經受高壓滅菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2沖洗3×5min。
（2）0.1mol/L甘氨酸PBS沖洗5min。
?。?）0.4% Triton X-100 PBS 15min。
?。?）1μg./ml蛋白酶K（0.1mol/l Tris HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配），37℃保溫30min。
?。?）4%多聚甲醛PBs 5min。
?。?）PBS沖洗2×min。
（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配）10min。
?。?）2×SSC沖洗10min。
?。?）將切片用滅菌吸水紙吸干，然后入雜交液。核酸探針濃度為0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠腦冠狀切片15μl雜交液足夠。43℃保溫12～16h。
?。?0）4×SSc 37℃沖洗30min。
（11）2×SSC（含RNasea 20μg/ml）37℃保溫30min。
?。?2）1×SSC和0.5×SSc 37℃分別沖洗30min。
?。?3）0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
（14）0.5%H2 O2 PBS室溫20min。
?。?5）0.05mol/l PBS 沖洗2×5min。
?。?6）堿性磷酸酶標記抗地高辛抗體（Fab）與抗蛋白或多肽等抗體混合液，前者一般1：1000稀釋，后者則因抗體而異。稀釋液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2，4℃孵育24h。
（17）0.05mol/l PBS沖洗4×5min。
?。?8）二抗（1：100～1：200）37℃保溫1h。
?。?9）0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
?。?0）PAP（1：200～1：400）37℃保溫1h。
?。?1）0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
（22）DAB顯色液（0.05%DAB + 0.03% H2 O2 ,0.05mol/L PBS pH7.2配）顯色5～10min。
（23）0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
（24）TSM，沖洗2×5min（TSM1 ：0.1mol/l Tris HCl pH8.0,0.1mol/L NaCl,0.01mol/L MgCl2 ）.
（25）硝基四氮唑藍（400μg/ml）和5-溴-4-3-吲哚磷酸（200μg/ml）混合液（TSM2 配顯色混合液）顯色1～3h，避光。
（26）20mmol/l EDTA終止顯色。
?。?7）將切片貼于涂有鉻礬明膠的載片上，空氣干燥。
?。?8）梯度酒精脫水，透明、封片。
結果：ISHH陽性細胞的胞質呈紫藍色，胞核不著色，示該細胞含XmRNA。ICC陽性細胞的胞質呈棕色，胞核不著色示該細胞含X多肽。雙標記細胞的胞質為藍棕混合色，示多肽與mR－NA共存于該細胞內。
第五節 原位雜交免疫細胞化學技術的未來與展望
自1969年以來，我們高興的看到原位雜交免疫細胞化學技術已從分子生物學的一個分支發展成為生命科學的有效的研究方法。
在原位雜交免疫細胞化學發展過程中兩個關鍵性的突破是核酸探針制備的標記物的改進。核酸探針由克隆的核酸探針發展到無克隆的合成的寡核苷酸探針；從放射性同位素標記到非放射性標記。令人可喜的是，這一技術還處于不斷的改進和更新的過程中。
一、PCR與原位雜交細胞化學結合法
自1988年以來On等科學家相繼在研究對導致人類免疫缺陷的HIV-1/AIDS病毒DNA進行細胞內定位，以期提高對患者的陽性檢出率。在系列研究的基礎上，Bagasra及其同事在1990～1993年成功的報告了原位雜交及聚合酶鏈反應結合法，簡稱為原位雜交PCR（PCr in situ, PCRIS）。
在本書二十二章 中曾介紹了PCR技術，它是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的無細胞克隆技術，基本步驟包括高溫變性，低溫退火適溫延伸三個步驟的反復熱循環，其效率可使幾個拷貝的模板序列甚至一個DNA分子擴增107 ～109 倍。大大提高了DNA的檢測率。
此法不足之外，在于其不能達到細胞或組織的定位。PCRIS技術的基本的原理是首先利用PCR技術將靶DNA片段擴增，然后用原位雜交細胞或免疫細胞化學技術通過標記的核酸探針與擴增了的DNA進行雜交顯示和定位，其敏感性可達到顯示單個拷貝基因的信號的程度。Bagasra及其同事們利用這一方法，應用32 P和生物素標記的核酸探針分別對導致人體免疫缺陷的HIV-1/AIDS病毒DNA的單個拷貝基因經PCR擴增后在外周血單核細胞內顯示成功。
就算此法對HIV-1感染患者外周血單核細胞檢測的陽性率明顯高于用單純原位雜交技術的檢出率，說明其敏感度大于單純的原位雜交免疫細胞化學技術。
其主要實驗步驟為將離心沉淀的細胞滴入覆有聚四氟乙烯（teflon coated）的設有三個凹孔的特制玻片（CellLine Associ－ates,Newfield, NJ ,Cat No 10～ 12,12～14mm的孔）的凹孔內，加熱105℃90s，然后以2%多聚甲醛-磷酸緩沖液，pH7.4，固定1h，PBS漂洗3min×3。如用生物素標記核酸探針，應用0.3%的H2 O2 孵育37℃過夜，然后以蛋白酶K溶液（5μg/ml PBS）55℃孵育2h（孵育時間應根據細胞的種類而定），將孵育的載片置于96℃熱板上2min，最終以蒸餾水漂洗，空氣干燥。
在溶液中按PCR技術的需要加入20PM一對應的引物（Primer），15μg PCR混合液含10μmol/l dATP、dCTP、dGTP和dTTP、50mmol/l KCl,10mmol/L Tris(pH8.3),2.5mmol/L MgCl2 和10μl Taq多聚酶（lu/μl,Gene Amp Cetuo）。
把上述溶液加入左側二孔中，留一孔加入無引物的PCR混合液作為對照。將載片以22×66mm蓋片覆蓋，片周以無色指甲油封閉，放入自動的熱循環儀（M.J.Re－seasCH,Boston MA）?？筛牧加娩X錫箔紙覆蓋于熱循環儀表面再放置載片。
按94℃/45℃/72℃每個溫度1min，30個循環。這溫度也可根據引物的GC比例加以調整以求得理想的擴增。也可根據下列公式計算引物的Tm值（Muller & Wold,1989）。
引物Tm=81.5 + 16.6(logM) + 0.41(%GC)500/n
n=引物的長度，mol/L=緩沖液中鹽的摩爾數，一般是0.047mol./L
按擴增后，將切片放入100%乙醇3～5min，以銳利刀片移除蓋片，將載片放在90℃熱板上30s，應用2×SSC漂洗，然后用生物素標記核酸探針進行雜交。載片在95℃熱板上5min，然后移入溫盒，48℃孵育4h或過夜。
次日PBS漂洗，以抗生物素標記FITC抗血清（100μg/ml PBS pH7.2）37℃孵育1h，PBS沖洗，以甘油/PBS溶液封片，熒光顯微鏡觀察。
如生物素標記核酸探針的顯示系統為過氧化物酶，則應用DAB/H2 O2 溶液顯色，常規光鏡觀察。這一技術不僅提高了病毒HIV-1的偵檢率，而且可用以確定細胞內攜帶的特殊基因，遺傳片段，病毒和腫瘤的侵犯（load）等，是一項頗具廣闊應用前景的實驗技術。
二、快速原位雜交細胞化學技術
原位雜交免疫細胞化學技術存在的難點之一是實驗手續繁瑣，實驗周期長。國外Liesi等（1986）和國內學者何彬等應用光敏生物素-鏈親合素（Biotin-streptavidin）膠體金系統進行原位雜交，得到了快速滿意的結果，全部實驗可在數小時內完成。
作用把含某種多肽或蛋白的cDNA片段的質粒，按照第十九章 在光照下標記光敏生物素，然后經DNA酶消化1h，得到大量100～500bp長度的混合片段，變性后用于原位雜交。
如為培養細胞或細胞涂片，用95%乙醇、5%乙醇固定5min，PBS沖去固定液，加含探針的雜交液覆蓋（光敏生物素標記探針濃度為2.5ng/μl），在溫盒中50℃孵育1～2h，取出后直接加入膠體金標記鏈親合素（1mg/ml）室溫孵育15min，然后在室溫或37℃下用大容量（200ml/每片）洗脫液（2×SSC，0.1%Triton X-100）分別沖洗5～10min，以銀顯影液放大金顆粒顯示原位雜交結果，可用1%伊紅復染，脫水，透明，封片，鏡檢。
如為冰凍切片（cryostat section 10～15μm），應經新鮮配制4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS沖去固定液，吸干后滴加蛋白酶K（25μg/ml,Sigma）37℃15min，再用4%多聚甲醛室溫固定20min，PBS沖去多聚甲醛，晾干后按上述方法進行原位雜交和雜交后沖洗。
三、原位啟動標記法
原位啟動標記法（Primed in situ labelling,PRINS），又叫寡核苷酸啟動法（Oligonucleotide－priming method）是Koch（1987）首先提出的，其基本原理是將未標記的寡核苷酸探針與細胞或組織中的靶DNA或RNA進行雜交，然后該寡核苷酸探針充當引物的作用，在Kelow多聚合酶的催化作用下，將生物素（或地高辛、熒光素）標記的核苷酸編入，以達到原位顯示的目的。
PRINS技術具有3個方面的優點：首先由于探針在雜交時是未標記的，僅在雜交之后才進行標記，因此背景染色很低。至少，從理論上講，背景染色幾乎是零。其次是有效地縮短了實驗的時間，由于探針未經標記，無增加背景染色的顧慮。
因此，可增加探針嘗試，縮短反應時間。雜交反應時間只需1h。實驗反應時間的縮短可有效的保持細胞或組織結構的完整性。第三個優點是能提高或增加信號的強度。Koch等曾成功的將此方法應用于染色體制片、單層細胞涂片和組織切片。它們還將此法與流式細胞計相結合以達到檢測群體離散細胞的目的。
在染色體或單層細胞涂片，載片在70℃的溶液中變性（70%甲酰胺，2×SSC）2min，立即在系統酒精中脫水（70%，80%，90%，95%,100%，V/V），用吹風機吹干。
預孵育在37℃～53℃20～30min，孵育時間加蓋玻片，孵育液含2～4pmol寡核苷酸探針，dATP，dCTP，dGTP各10mmol,5mmol生物素-11-dUTP在25μl×NT緩沖液中（1×NT緩沖液含50mmol/l Tris HCl,pH7.2,10mmol/L MgSO4 ,100μM二硫蘇糖醇（dithio threitol）,50μg/ml牛血清白蛋白），在預孵育時加入1μl的Klenow多聚酶。
應用100ml 50mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl在65℃洗1min 以終止反應，然后放入100ml×BN緩沖液（100mmol/l NaHCO3 ,Ph8.0,0.01% Nanidet P-40）40℃，進行檢測系統的顯示如熒光-親合素標記，過氧化物酶-親合素標記等。
總之，自Gall 和Pardue 1969年建立雜交免疫細胞化學以來的20余年中，已有不少新的改良的方法出現，但基本原則仍為Gall和Pardue所建立的相仿。作者個人體會是任何方法需在本人的實驗實踐中加以體驗和改良。
比如目前對乙?；饔茫唇氪姿狒腿掖及肥欠衲軠p低背景染色的問題有作者對此提出異議。在科技工作者認為在原位雜交實驗的所有應用溶液中加入0.1%～0.2%的二乙基焦碳酸乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）能有效的減低背景染色，但有些作者對此持懷疑態度。
蛋白酶K的消化作用曾被認為是增加細胞或組織滲透性的關鍵步驟，但有作用在自身的實驗室實踐中體會除結構較致密的組織如腦、脊髓等外，對培養或涂片的單層細胞、蛋白酶K的消化及預雜交均是可以省略的。本文列舉各作者的操作步驟略有不同，可能是基于這個原因。
目前，原位雜交技術主要應用于基因組圖（Gene mapping），基因表達定位（localization of gene expression），核DNA和RNA的排列，mRNA的排列和運輸（arrangement and transport of mRNA），復制（replication）和細胞的分類（sorting of cells）。
臨床研究應用在細胞遺傳學（Cytogenetics），生前診斷（Prenatal diagnosis），腫瘤和傳染性疾病的診斷，生物學劑量測定（biological dosimetry）和病毒學的病原學診斷等。
隨著核酸探針的制備，標記方法和基本操作方法的不斷改進，新的技術不斷涌現，相信在不久的將來，原位雜交化學技術將會更廣泛的被應用于各個學科，并不斷為生命科學提供新的資料，開拓新的領域。
參考文獻
1. Gall G & pardue ML.Formation and detection of RNA DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Nat Acad Science.U.S.A,1969,63:378～ 381
2.Glaid,et al. The use of complementary RNA probes for the identification and localisation of peptide messenger RNA in diffuse neuroen－docrine system. In : in situ hybridisation, Application to developmental biology and medicine Eds:N1 Narris and D.G Wilkinson, Combridge University press, 1990,43～68
3.Coulton G.Non radiosotopic labele for in situ hybridization histochemstry: a histochemist’s view. In: in situ hybridization,application to developmental biology and medicine. Eds: N1 Narris and Dg wilkinson, Combridge university Press, 1990:PP1～32
4.Plak JM,Mcgee JOD(Eds).In situ hybridisation principles and practice. New York :Oxford Oxford University Press, 1991
5.Forster AC, et al. Non-radioactive hybridisation probes prepared by chemical labelling of DNA and RNA with a novel reagent photobitio.Nuci Acids Res, 1985;3:745 ～761
6.Bagasra O, et al. Polymerase Chain Reaction in situ:intracellular amplificaton and detection of HIV 1 proviral DNA and other specific genes. J. Immunological Methods, 1993;158～145
7.Behringer Man heim, Biochemica. Neuradioactive in situ hybridisation application Manoal, 1992
8.Cai WQ(蔡文琴),et al. In situ hybridisation of atrial natriuretic peptide mRNA in the endothelial cells of human umbilical vessels. Histo－chemistry, 1993;100:277 ～ 283
9.Koch J, et al. Oligonucleotide priming methods for the chromosome specific labelling of alpha satellite DNA in situ. Chromosoma,1989;98:259～ 265
10. Barbara T, Pinkel D. Fluorescence in situ hybridisation with DNA probes. In : Flow cytometry (Eds zbigniew Darzynkiewice and Harry A.Crissman ) Academin press Inc, 1990;383～400
11. Liesi P, et al. Specific detection of neuronal cell bodies in situ hybridisation with a biotin labelled neurofilament cDNA probe J. His－tochem Cytochem, 1986 July;34(7):923～926
12. 正向華，蔡文琴，等.用光敏生物素反意生長抑素(SS)cRNA探針顯示組織切片中ss mRNA。解剖學雜志，1992，15（4）：312～313
13.正向華,張俐.應用反意生長抑素cRNA探針原位雜交顯示大鼠下丘腦生長抑素mRNA.解剖學雜志,1990,13(4):307
14.何彬,等.一種快速敏感的原位雜交方法.解剖學雜志,1992;15(4):312～313
15.向正華,蔡文琴,等.原位雜交組織化學與免疫組織化學結合法的研究.解剖學雜志,1993,16:451～454
