TaqMan Pri-miRNA Assays：檢測MicroRNA表達的起源
【摘要】 初級microRNA（pri-miRNA）是長鏈非編碼RNA轉錄本，至少有一個（更常見的是多個）約65 nt莖環結構的前體microRNA（pre-miRNA），這些前體microRNA中含有成熟的microRNA（miRNA）序列。TaqMan Pri-miRNA Assays讓這種新“基因”種類的轉錄能夠輕松方便地定量，其靈敏度和特異性足夠分辨多個miRNA位點。
初級microRNA（pri-miRNA）是長鏈非編碼RNA轉錄本，至少有一個（更常見的是多個）約65 nt莖環結構的前體microRNA（pre-miRNA），這些前體microRNA中含有成熟的microRNA（miRNA）序列（圖1）。pri-miRNA轉錄本的切割最終導致具生物活性的成熟miRNA的釋放，最終實現對信使RNA靶點的降解，或更常見的是翻譯阻遏。
分析設計與選擇
所有的TaqMan? Pri-miRNA Assays都是利用Applied Biosystems最新的TaqMan? 分析設計算法來設計的，此算法帶來了金標準的分析性能和數據質量。由于pri-miRNA轉錄本還未詳盡地定位，所以分析在設計時很接近Sanger miRBase數據庫中每個莖環序列，確保對含有目的成熟miRNA的初級轉錄本進行準確測定。此方法的額外優勢是，每個公開的莖環都有一個配對的TaqMan? Pri-miRNA Assay和TaqMan? MicroRNA Assay，讓miRNA成熟途徑中任一階段的RNA序列都能獨立地定量。
設計過程一開始將莖環序列定位到最新版本的人、小鼠和大鼠基因組中。接下來，在莖環結構任一側緊挨著的500個堿基對的區域都作為設計對象，并選擇出得分最高的分析（圖2）。不定位在單個染色體坐標的分析會嚴重扣分，幫助確保最終精選的分析測定了單個基因組位置的轉錄。
來自Sanger miRBase的莖環序列與基因組比對。在莖環任一側延伸500個堿基對的側翼序列作為分析設計的對象。
為了方便起見，TaqMan? Pri-miRNA Assays和TaqMan? MicroRNA Assays都能用相同的在線界面來平行識別、選擇和購買。利用新的比對定位瀏覽器可簡化對兩種分析類型之間的空間關系的了解（圖3）。
TaqMan? Pri-miRNA Assays和TaqMan? MicroRNA Assays的位置共同顯示在莖環序列（綠色空心框）和成熟miRNA序列（綠色實心框）的背景下，讓每個分析在初級轉錄本上的空間關系能很容易地理解。更多的分析細節顯示在右側。灰色區域代表了作為分析設計對象的區域。
應用
TaqMan? Pri-miRNA Assays讓這種新“基因”種類的轉錄能夠輕松方便地定量，其靈敏度和特異性足夠分辨多個miRNA位點。這對于解決下列miRNA表達和功能性方面的關鍵問題非常理想：
? miRNA“基因”轉錄的調控
11%的成熟miRNA序列產生自多個基因組位點的轉錄。也就是說，成熟miRNA序列來自多個莖環，即多個pri-miRNA序列。通過利用特異針對各個pri-miRNA轉錄本的TaqMan? Pri-miRNA Assays，能將轉錄改變與目的miRNA在成熟水平所檢測到的變化直接關聯。
? miRNA生物發生的調控
最近的觀察數據表明，成熟途徑的多個步驟都受到調控（Heo，2008；Viswanathan，2008）。在闡明這些調控事件何時是成熟miRNA水平所檢測到變化的成因時，關鍵要排除初級轉錄本在基因水平的的轉錄變化。TaqMan? Pri-miRNA Assays是定量目前成熟途徑中初級轉錄本集合的理想工具，與特異針對成熟miRNA的TaqMan? MicroRNA Assays共同使用，能夠識別并鑒定出在成熟途徑水平上所發生的調控事件。
? Pri-miRNA轉錄本的定位
MicroRNA基因座一般是多順反子的，其中同一個初級轉錄本中多個miRNA序列聚集成簇。然而，許多pri-miRNA轉錄本的一級結構還未充分鑒定。利用獨特的設計方法，多個TaqMan? Pri-miRNA Assays之間的關聯度能夠成為一種獨特快速的方法，來定位miRNA莖環簇。
分析性能
TaqMan? Pri-miRNA Assays帶來了Applied Biosystem? TaqMan?分析所聞名的高靈敏度、極佳特異性和寬的線性動態范圍。由于分析靈敏度高，TaqMan? Pri-miRNA Assays只需要極少的樣品投入：低至1 ng的總RNA已足夠定量中等至高表達miRNA位點的表達。
與miRNA研究領域的頂尖研究人員合作，我們展示了分析在分辨包含密切相關的miRNA莖環序列的不同基因座上的能力（圖4）。這對于它們在研究基因調控這個重要方面的應用很關鍵。
利用含有pri-miRNA莖環mir-26a-1或mir-26a-2（它們共享同一個成熟hsa-miR-26a序列）的質粒，pri-mir-26a-2 TaqMan? Pri-miRNA Assay只檢測hsa-mir-26a-2質粒的特異性得到證實。（由韓國首爾國立大學的Young-Kook-Kim 和Narry Kim提供。）
流程
TaqMan? Pri-miRNA Assays采用了與所有Applied Biosystems? TaqMan? Gene Expression Assays相同的簡單方便流程。無論是兩步法實時定量PCR（RT-qPCR）步驟的可靠性，一步法RT-qPCR步驟的便利性，還是快速循環的速度，Applied Biosystems都提供了經過驗證的試劑盒，支持這些不同的分析流程。在定量前必須確保樣品是不含DNA的，這一點很重要，因此分析經過了額外的驗證，利用Ambion? TURBO DNA-free? Kit來進行樣品的預先純化。
介于TaqMan? Gene Expression Assays和TaqMan? Pri-miRNA Assays共享相同的設計方法和實驗流程，同樣多種選擇的TaqMan? Gene Expression Assays的內源對照分析也推薦與TaqMan? Pri-miRNA Assays共同使用。
? 高度特異——單個基因組位點的定量microRNA轉錄
? 快速、簡單，可擴展——兩步法RT-qPCR提供了高質量的結果
? 新視角——在基因水平測定microRNA的表達
