cDNA合成技術

Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系統采用M-MLV反轉錄酶的RNase H缺失突變株取代AMV反轉錄酶，使合成的cDNA更長。該系統的第一鏈合成使用M-MLV反轉錄酶，cDNA第二鏈合成采用置換合成法，采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ進行置換合成，最后用T4 DNA聚合酶切去單鏈末端，方法簡便易行。該系統試劑包括：

20μg 特異性引物

200μl M-MLV第一鏈緩沖液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃時); 375mmol/l KCl; 　15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP， dCTP， dGTP， dTTP混合物(各2.5mmol/L)

2×625μ rRNasinR RNA酶抑制劑

10，000μ M-MLV反轉錄酶， RNase H-

5μg 對照RNA

400μl M-MLV第二鏈緩沖液(10×)，配方如下：

400mmol/L Tris·Cl ，pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;

30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。

500μ RNase H

500μ DNA聚合酶Ⅰ

100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ

2×1.25ml 不含核酸酶的水

以上所有試劑除對照RNA需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40μg mRNA。

（一） 第一鏈合成

1. 試劑

[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE-飽和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液。

2. 操作步驟

(1) 取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管，加入RNA模板和適當引物，每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接頭，使用0.3μg)，用H2 O調整體積至15μl， 70℃處理5分鐘，冷卻至室溫，離心使溶液集中在管底，再依次加入。

5×第一鏈緩沖液 5μl

rRNasin RNA酶抑制劑 25U

M-MLV(H- )反轉錄酶 200U

H2O調至總體積25μl

(2) 用手指輕彈管壁，吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。

(3) 37℃(隨機引物)或42℃(其它引物)溫浴1小時

(4) 取出置于冰上

(5) 摻入測定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA終止反應，并使總體積為100μl。可取90μl進行電泳分析(先用苯酚抽提)，另10μl進行同位素摻入放射性活性測定。

(6) 第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成

注：以上25μl反應總體積中所用RNA量為1μg，如合成5μg RNA，則可按比例擴大反應體積， 倒5μg RNA使用125μl總體積進行合成。