miRNA的功能分析策略
【摘要】 在發(fā)育或分化的不同階段以及疾病模型中，利用miRNA特異的芯片能繪制出細胞和組織的miRNA表達譜，這能夠揭示出參與了這些進程的特定miRNA。miRNA的過表達和沉默，則是一種有力的方法來研究miRNA的功能。這些研究應(yīng)當(dāng)在細胞內(nèi)或體內(nèi)進行，并與表型和基因表達分析相結(jié)合。
【關(guān)鍵詞】 miRNA 定向克隆 Dicer酶
lin-4，第一個已知的miRNA，在1993年被發(fā)現(xiàn)。自此，miRNA的研究就一發(fā)不可收拾。線蟲、果蠅等模式生物的研究鑒定出miRNA的許多重要功能，包括發(fā)育期間細胞增殖和死亡的協(xié)調(diào)，抗逆性，脂肪代謝等等。相對于這些低等的模式生物，哺乳動物的miRNA功能研究可就復(fù)雜得多。
在開始的幾年，科學(xué)家們的首要目標是利用克隆、生物信息學(xué)和基因表達等方法編纂出完整的miRNA目錄和它的表達方式。隨著這個目標日益接近，研究重心又轉(zhuǎn)移至miRNA功能的闡釋。針對這一目標，涌現(xiàn)出多種技術(shù)，有報告基因分析、原位雜交、過表達和沉默、生物信息學(xué)預(yù)測算法等，它們都有助于miRNA功能的推斷。
分析miRNA的表達
在鑒定新的miRNA時，通常采用三種方法：正向遺傳學(xué)、定向克隆和生物信息學(xué)分析。
正向遺傳學(xué)主要運用于果蠅和線蟲中，它通過一個突變表型來了解miRNA的功能。第一個miRNA基因lin-4就是這么鑒定出的。然而，正向遺傳學(xué)這么多年來也就鑒定出寥寥幾個miRNA。
這是因為miRNA很小，只要突變不影響種子序列，它們就有潛力耐受，因此很難擊中。另外，由于冗余，表型篩選不能識別很多miRNA突變體。因此正向遺傳學(xué)不可能成為鑒定miRNA的主力軍。
之后，定向克隆技術(shù)的出現(xiàn)，讓多種細胞系和組織中的miRNA大規(guī)模鑒定得以實現(xiàn)，包括人、小鼠和斑馬魚等。
miRNA的克隆流程大致如下：
在變性的聚丙烯酰胺凝膠上分離RNA樣品，并回收大小在18-25 nt的片段。接著，給RNA加上5’和3’接頭，并進行RT-PCR，然后將片段克隆到載體上，構(gòu)建出cDNA文庫。對單個克隆進行測序和分析，以確定小RNA。目前測序技術(shù)的蓬勃發(fā)展也大大促進了這種方法。然而對于某些只在特定細胞類型中表達，或以低水平表達的miRNA來說，鑒定起來還是有難度的。另外，介于物理性質(zhì)或轉(zhuǎn)錄后修飾，某些miRNA可能難以克隆，這也是一個棘手的問題。
同時，科學(xué)家們也開發(fā)出多種算法，來預(yù)測miRNA。所有方法都利用了二級結(jié)構(gòu)信息，因為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的存在是miRNA的主要特征。
其中許多方法還依靠序列的保守性來區(qū)分miRNA候選物和無關(guān)的基因組發(fā)夾。另一些方法則評估發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性，與已知miRNA的序列和結(jié)構(gòu)相似度。另一種高效的方法是探索已知miRNA周圍的基因組序列，因為許多miRNA都是成簇排布。
人和小鼠的許多miRNA就是通過這種方式鑒定出的。當(dāng)然，計算機預(yù)測出來的候選miRNA還需要實驗的驗證。
有時，我們并不需要全盤了解所有miRNA，而只是想了解發(fā)育或分化的不同階段、某種疾病狀態(tài)下特異表達的miRNA。這時，芯片就成為一種強大的工具，能監(jiān)測組織特異的miRNA表達，幫您挑出關(guān)鍵的miRNA。
目前市場上多個miRNA芯片包括了最新的Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫14.0版的內(nèi)容，讓您能緊跟形勢。盡管最初miRNA芯片的交叉雜交和特異性為人詬病，但經(jīng)過改進，很多已經(jīng)能夠分辨出單個堿基的差異。
有了它，人們繪制出細胞分化期間的miRNA表達譜；有了它，人們了解到疾病狀態(tài)下異常的miRNA表達模式。ABI公司還開發(fā)出一種類似芯片的TaqMan miRNA Array，在一張微流體卡片上集合了數(shù)百個TaqMan miRNA Assay，盡管通量不如芯片高，但發(fā)揮了TaqMan分析的優(yōu)勢——高靈敏度、高特異性和寬動態(tài)范圍。
鑒定miRNA的功能
miRNA的功能研究與基因相似，過表達和沉默是兩種有力的方法。miRNA的誘導(dǎo)表達常常是許多研究的第一步。將miRNA模擬物（多個公司有售）轉(zhuǎn)染到細胞中，就能實現(xiàn)miRNA的瞬時過表達。但長期研究就要依賴質(zhì)粒了。這些重組質(zhì)粒能源源不斷地產(chǎn)生有功能的miRNA，設(shè)計起來也很簡單。
利用常見的蛋白表達載體，將miRNA序列克隆上去，在Dicer酶的切割下，就能產(chǎn)生成熟的miRNA。一些研究小組還將這些質(zhì)粒引入腺病毒或慢病毒系統(tǒng)，以克服原代細胞或干細胞的轉(zhuǎn)染效率低，或?qū)iRNA導(dǎo)入小鼠體內(nèi)。不過，僅有miRNA過表達的結(jié)論往往不讓人信服，我們還需要功能喪失（loss-of-function）實驗來證實。
對于小鼠中的miRNA研究，科學(xué)家們開發(fā)出一些遺傳方法，來產(chǎn)生功能喪失的突變。
目前主要有三種：
(1) Dicer酶的突變，讓所有成熟的miRNA都缺失；
(2) 小鼠中miRNA基因的敲除；
(3) miRNA 靶位點的突變。不過，miRNA的高度冗余讓這種功能喪失研究面臨不小的挑戰(zhàn)。而且，許多miRNA是成簇排列的，一個miRNA的缺失或干擾可能會影響多順反子轉(zhuǎn)錄本的正確折疊和加工，從而影響相鄰miRNA的表達。近年來使用較多的是反義靶定的非遺傳學(xué)方法。多個公司提供miRNA抑制劑。這些2’-O-甲基修飾的寡核苷酸不可逆地抑制了miRNA的功能。
上述方法提供了miRNA體外和體內(nèi)功能研究的框架。在發(fā)育或分化的不同階段以及疾病模型中，利用miRNA特異的芯片能繪制出細胞和組織的miRNA表達譜，這能夠揭示出參與了這些進程的特定miRNA。miRNA的過表達和沉默，則是一種有力的方法來研究miRNA的功能。這些研究應(yīng)當(dāng)在細胞內(nèi)或體內(nèi)進行，并與表型和基因表達分析相結(jié)合。
與轉(zhuǎn)錄因子類似，miRNA也是一大類基因調(diào)控分子。它們獨特的作用方式需要新的分析策略。系統(tǒng)鑒定miRNA以及研究特定miRNA過表達或沉默的生物影響的技術(shù)已經(jīng)有了，但是還需要了解影響miRNA功能的信號通路，以及影響miRNA表達的環(huán)境因素或遺傳因素。一旦獲得這些信息，研究人員才有可能設(shè)計出新的治療策略，來治療遺傳和獲得性疾病。
