cDNA文庫組標準流程

第一部分 Total RNA 的提取

一、 試劑配制

準備工作：

1、研缽、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、藥匙、 試劑瓶等玻璃制品均用錫紙包裹口部，置于烤箱內(nèi),180℃，烤6小時。

2、50ml/1.5ml離心管、槍頭等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡過夜后，121℃ 20mins 高壓滅菌。

3、電泳槽及電泳托、梳子用3%雙氧水處理。

4、常用試劑及其配方：

▲DEPC水：在1000ml去離子水中加入100ul DEPC, 靜置過夜后高壓滅菌。

▲0.78M檸檬酸納：PH=4~5

三水合檸檬酸納 22.94g

加DEPC水定容至100ml，室溫放置備用。

▲10%肌氨酸鈉：

肌氨酸鈉 10g

加DEPC水定容至100ml，室溫放置備用。

▲變性裂解液：

0.78M檸檬酸鈉 8.25ml

10%肌氨酸鈉 12.375ml

異硫氰酸胍 118.05g

加DEPC水定容至 250ml，室溫放置備用

臨用前加β-巰基乙醇使其終濃度為1%（v/v）

▲2M 醋酸鈉 PH=4.5

NaAc?3H2O 13.6g

加DEPC水定容至50ml,高壓滅菌，室溫放置備用

▲3M醋酸鈉PH=5

NaAc?3H2 O 20.4g

加DEPC水定容至50ml,高壓滅菌，室溫放置備用

▲ 4M LiCL:

LiCL 24.164g

加DEPC水定容至100ml,高壓滅菌，室溫放置備用

▲0.5M EDTA PH=8.0

EDTA 18.61g

用NaOH調(diào)PH值至8.0，定容到100ml，高壓滅菌，室溫放置備用

▲10X MOPS (3-（N-嗎啉代）丙磺酸):

MOPS 41.86g

NaAC?3H2O 4.10g

0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml

用NaOH調(diào)PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室溫避光放置備用。

▲1x MOPS:

10x MOPS 30ml

加DEPC水270ml，用時現(xiàn)配。

▲4x RNA Loading buffer:

10x MOPS 400ul

甘油（高壓過） 200UL

溴酚蘭 10ul

甲醛(37%) 72ul

去離子甲酰氨 310ul

EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul

ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul

在4℃ 可保持3個月

▲10x PBS

pH=7.4

NaCl 80g

KCl 2g

Na2HPO4 14.4g

KH2PO4 2.4g

定容至1000ml

▲變性電泳膠：

稱取0.5g瓊脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加熱至瓊脂糖熔化后，冷卻至50℃左右，加入2.5ml甲醛，輕輕混勻后倒入電泳托上。

▲變性電泳緩沖液：

在250ml容量瓶內(nèi)加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml。