RNase Protection Assay--RNA酶保護試驗
RNA酶保護試驗(RNase Protection Assay,RPA)是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。與Northern雜交和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優點：
1． 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。
2． 由于PCR擴增過程中效率不均一和反應“平臺”問題，基于PCR產物量進行分析所得數據的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數據真實性較高。
3． 由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。
4． 步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。
5． RNA-RNA雜交體穩定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。
6． 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。
7． 檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。
RPA的缺點是需要同位素標記探針。
一、試劑準備
1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。
2. 雜交緩沖液:PIPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。
3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml
二、操作步驟
1．反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產物為模板制備，本文介紹后者。
（1）設計含T7啟動子的PCR引物
由于PCR產物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5’-端要含T7啟動子序列: T7啟動子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG
引物設計的其他要求與一般PCR引物的設計相同。PCR產物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設計時可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示
（2）PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ進行PCR，再以PCR 產物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進行二次PCR(具體操作參見PCR章節)。
（3）探針合成標記與純化
在0.5ml 離心管中加入下列試劑：
RNasin （40U/μl） 0.5μl
GACU POOL GAC
（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM） 2μl
[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl
DTT (二硫蘇糖醇，0.1M) 1μl
5×轉錄 buffer 2μl
模板（50ng/μl） 1μl
T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl
混合后，短暫離心，37℃保溫1hr。
加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37℃ 15min, 然后75 ℃ 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。
加入：飽和酚 50μl
氯仿 50μl
酵母tRNA（2μg/μl） 4μl
DEPC H2O 100μl
室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預冷無水乙醇250μl，混勻后，-20℃靜置30min。4℃離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗滌，4℃離心13500g×2min, 棄上清液。室溫下揮發殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質量。
