RNA 的提取
RNA 提取物的完整性是進行電泳的主要目的之一。在有EB 存在時,完整未降解的RNA制品電泳圖譜應可清晰看到18S rRNA、28S rRNA 兩條帶,也應當能看到一條由tRNA、5.8SrRNA 和5S rRNA 組成的、較模糊遷移較快的條帶,且28S rRNA 條帶亮度應為18S rRNA的1.5-2 倍。
1、試劑耗材的準備:
(1) 試劑:
A. RNase-Free 水:配0.01 % (v/v)的Diethylpyr℃arbonate(DEPC)溶液,室溫保持過夜,次日高壓滅菌后,- 20 ℃ 保存。
B. 氯仿 (Chloroform),異丙醇(Isopropyl alcohol),分子生物學級別C. 75% 乙醇 (用 DEPC-treated 水配制)
(2) RNase 去除的耗材:用0.01% (v/v) DEPC 溶液完全浸泡過夜,高壓滅菌后烘干。
2、實驗步驟:
(1) 準備分離RNA 的細胞:
I. 懸浮細胞:
收集細胞,離心200 g,5 min。吸出培養(yǎng)液。每10 6 個細胞加入1 mL Trizol 裂解液,反復吹吸3 - 5 次,室溫下靜置10 min 后轉移至干凈的離心管中。
II. 貼壁細胞:
吸出培養(yǎng)液,每10 cm 2 生長面積的細胞加入1 mL Trizol 裂解液,反復吹吸3 - 5次,室溫下靜置10 min 后轉移至干凈的離心管中。
(2) 加入0.2 mL 氯仿(/ mL Trizol),振蕩15 sec 混勻后靜置2 min。
(3) 在4 ℃,12,000 g 離心15 min,混合液分成三層。
(以下所有步驟用到耗材均需用DEPC 處理并高壓滅菌。)
(4) 小心吸取最上層的無色水層于干凈的離心管中。加入0.5 mL 異丙醇(/ mL Trizol),室溫下靜置10 min。
(5) 在4 ℃,12,000 g 離心10 min,棄上清,加入1 mL 75% 乙醇(/ mL Trizol),振蕩混勻。
(6) 在4 ℃,7,500 g 離心5 min,棄上清。室溫下完全干燥5 - 10 min。
(7) 加入RNase‐Free 水溶解RNA 沉淀,分裝后在80 ℃ 保存