Northern blot實驗步驟
一、經乙二醛和二甲基亞砜變性處理后進行的RNA電泳
這一方法原于McMaster和Carmichael（1977）。含有乙二醛－DMSO的凝膠比含有甲醛的凝膠更難于進行電泳，因為前者泳動速率較慢而且需將電泳液時行循環以避免電泳過程中形成過高的H+梯度。盡管上述兩種凝膠具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含有乙二醛－DMSO的凝膠對RNA進行分級離，通常Northern雜交所顯示的RNA條帶更為銳利。
1、在滅菌的微理離心管內，混勻下列液體：
6mol/L乙二醛 5.4ul
DMSO 16.0ul
0.1mol/L磷酸（pH7.0） 3.0ul
RNA（多達10ul）5.4ul市售乙二醛通常為40%溶液（6mol/L）。由于接觸空氣的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通過混合床樹脂（Bio-Rad AG 501-X8 對乙三醛溶液進行去離子處理，直至溶液pH值大于5.0為止，然后可分裝在小份，用蓋緊的小管貯存于－20℃。
每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液體應予丟棄。0.1mol/L磷酸鈉（pH7. 0）的配法如下：將3.9ml 1mol/L磷酸二氫鈉、6.1ml 1mol/L磷酸氫二鈉和90ml 水混合，用DEPC處理上述溶液后高壓滅菌。每一泳道至多可分析10ug RNA，通常用10－20 ug 細胞總RNA進行Northern雜交，可以檢測高豐度mRNA（占mRNA總量的0.1%以上），如等測RNA含量極微，每個泳道應加0.5－3.0ug poly（A）+RNA。
2、將微量離心管蓋嚴，將RNA溶液置于50℃溫育60分鐘后，用冰水浴冷卻樣品，離心5秒鐘，使管內所有液體沉降至管底。
3、于50℃溫育RNA溶液的同時，灌制瓊脂糖水平凝膠，用1.4 %瓊脂糖分析1kb 以下的RNA樣品， 而用1%瓊脂糖分析1kb 以上的RNA樣品。加入0.1mmol/L 磷酸鈉（pH7. 0 ）后，升溫至70 ℃， 加入碘乙酸鈉固體至終濃度為10mmol/L（使RNA酶失活），再降溫至50℃，制膠，加入RNA樣品前一至少放置30分鐘使其凝固。
用于RNA電泳的電泳槽需用去污劑溶液洗凈，用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3%H2O2，于室溫放置10分鐘后，用經DEPC處理的水徹底沖洗電泳槽。因乙二醛可與溴化乙錠發生化學反應，所以制膠和電泳過程中誚避免作用溴化乙錠。
4、將RNA樣品冷卻至0℃，加入4ul 滅菌的并經用DEPC處理的戊二醛-DMSO凝膠中樣緩沖液，隨后立即將上述樣品加至凝膠加樣孔。用已知大小的乙醛酰RNA作為分子量標準參照物，如用18S和28S rRNA或9S兔－珠蛋白mRNA，上述RNA長度分別為6322、2366和710個堿基。
也可以從BRL購置已知大小的RNA混合物作為分子量標準照物。通常分子量標準參照物的泳道位于凝膠邊緣，便于電泳后將其切去進行溴化乙錠染色，可能的話應在分子量標準參照物以及欲轉移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜的樣品之間留空一個泳道。
乙二醛-DMSO凝膠加樣緩沖液
50%甘油
10mmol/L磷酸鈉（pH7.0）
0.25%溴酚藍
0.25%二甲苯青FF
5、將凝膠浸入10mmol/L磷酸鈉電泳液中，以3-4V/cm電壓降進行電泳，同時按圖7.1對磷酸鈉容液時行持續再循環，使溶液pH值維持在可被接受的限度 內（pH>8.0時乙二醛將從PNA分子上解離）。另一方法為電泳時每30分鐘換一次磷酸鈉緩沖液。
6、電泳結束后（溴酚藍遷移出區8cm），切下分子量標準參照物的凝膠條，浸入溴化憶錠溶液（0.5ug/ml，
用0.1mol/L乙酸銨配制）中染色30-45分鐘。在凝膠放置一透明遲，在紫外燈下照片上每個RNA條帶至加樣孔的距離，以RPN片段大小的lg對數值對RNA條帶的遷移距離作圖，用所得曲線計算從凝膠移到固相支持體后通過雜交檢出的RNA分子的大小。
7、RNA從凝膠轉移至硝酸纖維素濾膜，將RNA轉移至尼龍膜。
二、將變性RNA轉移至硝酸纖維素濾膜
電泳完畢后，可立即將乙醛酰RNA自瓊脂糖凝膠轉移至硝酸纖維素濾膜，有以下幾種轉移方法：毛細管洗脫法、真空轉移法和電印跡法。毛細管洗脫法如下所述， 真空轉移法和印跡法則按有關儀器生產廠家產品說明書進行。盡管有人認為在轉移前對瓊脂糖凝膠進行預處理實屬不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983）。
但我們認為含甲醛的凝膠必須用經DEPC處理的水淋洗數次，除去甲醛。如果瓊脂糖中濃度大于1%或凝膠厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氫氧化納浸泡凝膠20分鐘。 然后在凝膠上放置硝酸纖維素凝膜或尼龍膜，RNA隨向上遷移的緩沖液轉移至固相支持體（硝酸纖維素濾膜或尼龍膜）上。
1、將凝膠移至一個玻璃皿內，用鋒利刀片修凝膠的無用部分，在凝膠左上角（加樣孔一端為上）切去一角，以作為下列操作過程中凝膠方位的標記。
2、用長和寬均大于凝膠的一塊Plexiglas有機玻璃或一疊玻璃板作為平臺，將其放入大千烤皿內，上面放一張Whatman 3MM濾紙，倒入20xSSC使液面略低于平臺表面，當平上方的3MM濾紙溫透后，用玻棒趕出所有的氣泡。
3、用一把新的解剖刀或切紙刀裁一張硝酸纖維素濾膜（Schleicher &Schuell BA85或與之相當的產品）。濾膜的長度和寬度應分別比凝膠大1mm， 接觸濾膜時須戴手套或用平頭鑷子（例如Millipore鑷子），用有油膩的手接觸過的硝酸纖維素濾膜不易浸溫。
4、將硝酸纖維素濾膜浮在去離子水表面，直至濾膜從下向上濕透為止，隨后用20xSSC浸泡濾膜至少5分鐘，用干凈的解剖刀片切去濾膜一角，使其與凝膠的切角相對應。不同批號的硝酸纖維膜，其浸濕速率相差懸殊。如濾膜池浮在水面上幾分鐘后仍未濕透，應另換一張新濾膜，因為未均勻浸濕的濾膜進行RNA轉移是靠不住的。這種濾膜也不必丟棄，可將其夾在用2xSSC浸濕的3MM濾紙中間，高壓5分鐘。通常上述處理足以使硝酸纖維素濾膜濕透。高壓處理的濾膜應夾在經過高壓理理并用2xSSC浸濕的3MM濾紙中間，裝入塑料袋，密封后于4℃保存備用。
5、將凝膠翻轉后置于平臺上溫潤的3MM濾紙中央，3MM濾紙和凝膠這間不能滯留氣泡。
6、用Saran包裝膜或Parafilm膜圍繞凝膠周邊，但不是覆蓋凝膠， 以此作為屏障，阻止液體自液池直接流至凝膠上方的紙巾層中。并非堆放得十分整齊的紙巾，易于從凝膠的邊緣垂下并與平臺接觸，這種液流的短路是導致凝膠中的RNA的轉移效率下降的主要原因。
7、在凝膠上方放置溫潤的硝酸纖維素濾膜，并使兩者的切角相重疊。濾膜的一條邊緣應剛好超過凝膠上部加樣孔一線的邊緣。濾膜置于凝膠表面適當位置后，就不應輕易移動，濾膜與凝交之間不應留有氣泡。
8、用2xSSC溶液浸濕兩張與凝膠同樣大小的3MM濾紙， 溫潤的放置在濕潤的硝酸纖維濾膜上方。用玻璃棒趕出其間滯留的氣泡。
9、切一疊（5-8cm高）略小于3MM濾紙的紙巾，將其放置在3MM濾紙的上方。并在紙巾上方放一塊越境玻璃板，然后用-500g的重物壓實。其目的是建立液體自液池經凝膠向硝酸纖維素濾膜的上行流路，以洗脫凝膠中的RNA并使其聚集在硝酸纖維素濾膜上。
10、使上述RNA轉移持續進行6-18小時，每當紙巾浸濕后，應換凝的紙巾。
11、轉移結束后，揭去凝膠上方的紙巾和3MM濾紙，翻轉凝膠和硝酸纖維素濾膜，以凝膠的一面在上，置于一張干的3MM濾約紙上，用一支極軟鉛筆或圓珠筆，在濾膜上標記凝膠加樣孔的位置。
12、從硝酸纖維素濾膜上剝離凝膠棄之。以6x SSC溶液于室溫浸泡濾膜5分鐘，這一步可以除去粘著在濾膜上的瓊脂糖碎片。從6xSSC溶液中取出濾膜，將濾膜上的溶液滴盡后平放在一張紙巾上。于室溫晾干30分鐘以上。為估計RNA的轉移效率， 可將膠置于溴化乙錠溶液（0. 5 ug/ml ， 以0.1mol/L乙酸銨配制）中染色45分鐘，于紫外燈下觀察。
13、將晾干的濾膜放在兩經張3MM濾紙中間，用真空爐于80℃干烤0.5-2 小時。如干烤時間過長，濾膜極易脆裂并可能發黃。如果濾膜并不立即用于雜交實驗，可用鋁箔寬松地包裹起來，在真空下貯存于室溫。
14、僅適用于濾膜上含有乙醛酰PNA的情況：雜交前需用20mmol/L Tris-Cl（pH8.0）于65℃洗膜，除去RNA上的乙二醛分子。
三、轉移至硝酸纖維素濾膜前后進行的RNA染色
當RNA自瓊糖凝膠轉移至硝酸纖維素濾膜之前，溴化乙錠的染色時間一般不宜過長，這是因為被染料飽和的核酸分子，其轉移效率有所降低。然而，用溴化乙錠作短暫染色，既不至于對核酸轉移過程產生可以察覺的掏作用，又獨具同時檢測凝膠和凝膜上的RNA的優點。
（一）方法I
1、電泳結束后，含乙二醛-DMSO的凝膠應浸入含溴化乙錠（0.5 ug/ml）的10mmol/L磷酸鈉（pH7.0）溶液。甲醛凝膠需用無RNA酶的水淋洗，用20xSSC溶液浸泡，隨后用含溴化乙錠（0.5ug/ml）的20xSSC溶液染色。
2、于室溫染色5-10分鐘，在紫外燈下觀察，照像。
3、按前所述方法， 將凝膠中的RNA轉移至硝酸纖維素濾膜，轉移后能常在學光下也可看出已染色的RNA條帶。
這種方法僅適用于每一泳道均含有相當大量（如5ug 以上）的RNA的情況。
（二）方法Ⅱ
硝酸纖維素濾膜上的RNA也可以用下述方法染色：從干烤后的硝酸纖維素濾膜上剪下所需的條帶進行染色，也可以用經過雜交并經X光片曝光后的整張濾膜進行染色（A.Efstratiadis，未了表材料）。
1）將干燥的濾膜浸入5%冰乙酸中，于室溫浸泡15分鐘。
2）再將濾膜轉移至0.5mol/L乙酸鈉（pH5.2）、0.04%亞甲藍溶液中， 于室溫浸泡5-10分鐘。
3）用水淋洗濾膜5-10分鐘后，可見RNA分子量標準參照物帶型銳利而poly（A）+mRNA為一模糊帶型，由許多長度范圍從500堿基以下至5kb以上的各種mRNA共同組成，mRNA的平均長度約為2kb。
四、雜交和放射自顯影
固定于濾膜上的RNA的預雜交、雜膠及淋洗等條件，與DNA雜交的相應條件基本相同。現簡述如下：
1、用下列兩種溶液之一進行預雜交，時間1-2小時。若于42℃進行，應采用：
50%甲酰胺
5xSSPE
2xDenhardt試劑
0.1%SDS
若于68℃進行，應采用：
6xSSC
2xDenhardt試劑
0.1%SDS
2、在預雜交液中加入變性的放射性標記探針，如欲檢測低豐度mRNA， 所用探針的量至少為0.1ug，其放射性比活度應大于2x108計數/（分?ug）在適宜的溫度條件下繼續溫育16-24小時。切記RNA只與雙鏈DNA中一條單鏈互補，因此如用單鏈探針， 則必須是能與RNA互補的一條單鏈。
3、用1xSSC、0.1%SDS于室溫洗漠20分鐘，隨后用0.2xSSX、0.1%SDS于68℃洗膜3次每次20分鐘。
4、用X光片（Kodak XAR-2或與之相當的產品）進行放射自顯影，附加增感屏于-17℃曝光24-48小時。
