siRNA的制備方法介紹

體外制備

1.化學合成

許多國外公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3―4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。

最適用于：已經找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究

不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素

2.體外轉錄

以DNA Oligo為模版，通過體外轉錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。

不足之處是實驗的規模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當的時間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小，穩定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉染效率更高。

最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。

不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。

3.用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA

其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法――制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。

選擇通常是200―1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞，方法和單一的siRNA轉染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。

dsRNA消化法的主要優點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因。現在多數的研究顯示這種情況通常不會造成影響。

最適用于：快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型。

不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療。

體內表達

前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉染試劑將siRNAs轉到細胞內。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優點在于不需要直接操作RNA。

4. siRNA表達載體

多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉錄的。

要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆 到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆 ，這個過程需要幾周甚至數月的時間，同時也需要經過測序以保證克隆 的序列是正確的。

siRNA表達載體的優點在于可以進行較長期研究――帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。

病毒載體也可用于siRNA表達，其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便,而且轉染效果更加穩定。

最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。

不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆 和測序等較為費時、繁瑣的工作）。

5. siRNA表達框架

siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNA pol III啟動子，一段發夾結構siRNA，一個RNA pol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。

因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩定表達siRNA和長效抑制的研究。

這個方法的主要缺點是①PCR產物很難轉染到細胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問題）②不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發現導致結果不理想。

最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子。

不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）