ATP的生物合成

一、目的

1.了解ATP生物合成的意義。

2.掌握無機磷的測定方法。

3.掌握DEAE-纖維素薄板層析法測ATP的形成。
二、原理

在適當條件下，釀酒酵母分解發酵液中的葡萄糖，釋出能量，同時還利用無機磷，使AMP轉變成ATP，一部分能量即貯存于ATP分子中。因此，在發酵過程中，可測得發酵液中的無機磷含量降低和ATP含量的上升。
三、實驗器材

1.釀酒酵母，新鮮釀酒酵母懸浮于蒸餾水中，離心，棄去上清液。如此用蒸餾水洗滌酵母數次，最后將洗凈的酵母沉淀冷凍保存①。

2. AMP、 ATP標樣

3.燒杯50 或100ml (1)。

4.電子分析天平。

5.水浴鍋。

6.離心機4000rpm

7.722型（或7220型）分光光度計。
四、實驗試劑

1.2%三氯醋酸溶液：2g三氯醋酸，溶于100 ml蒸餾水。

2.過氯酸溶液：0.8 ml過氯酸，加蒸餾水8.4 ml

3.阿米酚試劑：稱取阿米酚[amidol,二氫氯化-2，4-二氨基苯酚，分子式： （NH4）2C6H3OH?2HCl]2g，與亞硫酸氫鈉（NaHSO3）40g共同研磨，加蒸餾水200ml，過濾貯棕色瓶內備用。

4.鉬酸銨溶液：20.8g(NH4)6Mo7O24%26#8226;4H2O，溶于蒸餾水并稀釋至200ml.

5.1mol/L KOH溶液。

6.1mol/L HCl溶液。

7.ATP溶液：稱取ATP晶體（或粉末）50mg，溶于5.0ml蒸餾水，臨用時配制。

8.DEAE-纖維素薄板：參看輔助試驗。

9.1mol/L NaOH溶液。

10.0.05mol/L pH3.5檸檬酸鈉緩沖液：見輔助試驗。
五、操作

1.發酵

將0.1g KH2PO4及0.58g K2HPO4溶于3ml蒸餾水。

另將0.1g AMP溶于1ml蒸餾水，傾入上述磷酸鉀溶液內，加熱至37℃。酵母液5ml，再加4ml蒸餾水稀釋，加熱至37℃，倒入上述溶液中，再加MgCl2 0.016g及葡萄糖0.5g，再加蒸餾水3ml，混勻，立即取樣0.2ml，檢測AMP及無機磷的含量。

此時測得的磷稱為初磷。薄板層析圖譜上只有AMP斑點，無ATP斑點。以后每隔30min取樣測定，至明顯看出無機磷及AMP含量下降、ATP含量上升即可（約2h～3h）。

2發酵液樣品處理

將所取之0.2ml樣液置離心管中，立即加入2%三氯醋酸溶液1ml，搖勻，離心（3000r/min）10min。上清液用以測無機磷及ATP含量。

3.無機磷測定

吸取上清液0.3ml置于干試管內加過氯酸溶液8.2ml、阿米酚試劑①0.8ml、鉬酸銨溶液0.4ml，混勻，10min后比色測定A650nm。

本實驗無需求出無機磷的絕對量，故不作標準曲線。A650nm數值下降即表示無機磷下降。一般情況下，當A650nm下降至比初磷A650nm小0.2單位時，發酵液中既有較多的ATP。

4.DEAE-纖維素薄板層析法測ATP的形成：方法見輔助試驗，同時用ATP溶液作對照。

最好放在低溫冰箱冷凍結冰。經深凍得酵母，發酵效果好。

阿米酚試劑為還原劑。如用抗壞血酸，效果不好。

輔助試驗

一、目的

掌握DEAE―纖維素薄板層析法測定核苷酸的原理和方法。

二、原理

二乙氨基乙基纖維素，簡稱DEAE―纖維素，結構式如下：
帶負電荷的核苷酸離子就被交換上去。控制溶液的pH，使各種核苷酸所帶凈電荷不同，與DEAE―纖維素的親和力也就不同，從而達到分離的目的。

三、實驗器材

1. 玻璃片4×15cm（×4）。

2. 尼龍布。

3. pH試紙（pH1～14）。

4. 電動攪拌器。

5. 水平板。

6. 水平儀。

7. 鉛筆。

8. 紫外分析儀（254nm）。

9. 電吹風。

10. 燒杯1 000ml(×1)。

11. 吸濾瓶1 000ml(×1)。

12. 布氏漏斗%26oslash;20cm(×1)。

13. 微量點樣管10%26micro;l(×1)。

四、實驗試劑

1. 核苷酸樣品。

2. DEAE―纖維素（層析用）。

3. 1mol/L NaOH溶液。

4. 1mol/L HCl溶液。

5. 0.05 mol/L檸檬―檸檬鈉緩沖液（pH3.5）：稱取檸檬酸12.20g,檸檬酸鈉6.70g，溶于蒸餾水，稀釋至2 000ml。

五、 操作

1.DEAE―纖維素的處理

先用水洗，抽干后用4倍體積1mol/L NaOH溶液浸泡4h（或攪拌2h），抽干，蒸餾水洗至中性，再用4倍體積1mol/L HCl浸泡2h（或攪拌1h）抽干蒸餾水洗至pH4備用。

2.鋪板：將處理過的DEAE―纖維素放在燒杯里，加水調成稀糊狀，攪勻后立即倒在干凈玻璃板上,涂成均勻的薄層，放在水平板上，自然干燥或60℃烘干，備用。

3.點樣：在已烘干的薄板一端2cm處用鉛筆輕劃一基線，用微量點樣管取樣液10%26micro;l②，點在基線上，用冷風吹干。

4.展層：在燒杯內置pH3.5檸檬酸鈉沖液（液體厚度約1cm）,把點過樣的薄板傾斜插入此燒杯內（點樣端在下），溶劑由下而上流動，當溶劑前沿到達距離玻板上端約1cm處（10min左右）取出薄板，用熱風吹干，用260nm紫外線照射DEAE―纖維素層觀看斑點。DEAE―纖維素經處理可反復使用。此法具有快速、靈敏的特點
① 如長期不用，需于60℃以下烘干保存。

② 可用腺三磷粗品或藥用腺三磷結晶作樣品，樣液核苷酸濃度為每毫升5mg左右時，點樣量為5～10%26micro;l。可按此標準控制點樣量。