RNA酶活性的控制

為了獲得高質量的真核細胞mRNA, 必須使用RNA酶的抑制劑或采用下述的破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法，最大限度地降低細胞破碎過程中所釋放的RNA酶的活性。同時，避免偶然引入實驗室內其他潛在的痕量RNA酶也很重要。下面列舉避免RNA酶法染問題的一些注意事項。大多數有經驗的研究者并不拘泥于這些注意事項，只是在遇到問題時可能采用其中的一種或幾種方法加以解決。

一、實驗程序

如不謹慎操作，外源性RNA酶可以通過下述途徑污染RNA制品：

（一）玻璃制品、塑料制品和電泳槽

滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不經預處理直接用于制備和貯存RNA.實驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經常有RNA酶法染，使用前必須于180℃干烤8小時或更長時間（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1 %焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其他用品。DEPC是RNA酶的強烈抑制劑，但其作用并不是絕對的。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小時，然后用滅菌水淋洗數次， 并于100℃干烤15分鐘。在15 lbf/in2（1.034x105Pa）高壓蒸氯滅菌15分鐘。上述處理可以除去器甲上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾。

羧甲基化的RNA在無細胞體系中翻譯效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤堿基均被修飾，否則其形成DNA:RNA或RNA:RNA雜交休的能力并不明顯降低。用于RNA電泳的電泳槽應用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3%的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用0.1 %DEPC處理過的水徹底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標記，存放在指定地點，為RNA實驗專用。

（二）研究人員造成的污染

RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此，在準備分離的和分析RNA的材料和溶液時，主有涉及RNA的一切操作過程中，都應戴一次性手套，接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此進行RNA實驗時應勤換手套。

（三）污染的溶液

用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿。可能的話溶液均應用0.1%DEPC于37℃至少處理12小時，然后于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2（1.034x105Pa）的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。

注：DEPC可與胺類迅速發生化學反應，因些不能用來處理含有Tris 一類的緩沖液。可存幾瓶新的未開封的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。

二、RNA酶的抑制劑

下面介紹3種廣泛應用的特異性RNA酶抑制劑。

（一）RNA酶的蛋白質抑制劑

RNA酶的蛋白質抑制劑是從人胎盤分離的一種蛋白質可與多種RNA酶緊密結合（KI≈3x1010）形成非共價結合的等摩爾復合物，使RNA酶失活。

此蛋白質體內可能是血管生成素的抑制劑，血管生成素是氨基酸序列和推測的三級結構與胰RNA酶類似的一種血管生成因子， 幾個廠家以不同的商品名出售這種抑制劑，該蛋白質應置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50%甘油中，貯存于-20℃。抑制劑制品凍融數次后或放置在氧化條件下即應棄之不用，因為上述處理會使蛋白質變性從而釋放出所結合的RNA酶。因此，在使用變性劑裂解哺乳動物細胞這一提取RNA的初始步聚中不應使用這種蛋白抑制劑。

然而職用更溫和的裂解方法時應使用這種抑制劑，并且在后續的所有RNA純化步驟中均應有此蛋白質存在。由于酚抽提可以除蛋白質抑制劑，故應在純化過程中補加幾次抑制劑。其最大活性的發揮要求巰基試劑，而且它并不干擾反轉錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯。