人APC和TSC－2 cDNA的長5＇RACE
利用RACE [Rapid Amplification of cDNA ENDs，cDNA末端的快速擴增]，可以很簡單地得到mRNA的5＇末端序列，然而5＇RACE是一個很復(fù)雜的技術(shù)，它的成功依賴每一步反應(yīng)的有效完成。cDNA第一鏈的合成是由一個反義的基因特異性引物（Gene－specific primer，GSP）來起始的，cDNA第一鏈純化后，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）在cDNA的5＇末端加上一個合成的同聚核苷酸錨定序列。利用第二個巢式GSP和一個與同聚核苷酸尾巴可以退火的錨定引物來擴增cDNA的5＇末端。
用SUPERSCRIPTTM II RT從mRNA復(fù)制成cDNA 用RNase H和RNase T1降解RNA 用GLASSMAXò Spin Cartridge純化cDNA 用dCTP和TdT給純化的cDNA加尾 用精簡的錨定引物和巢式GSP2 PCR擴增dC加尾的cDNA 用AUAP和巢式GSP重新擴增初步PCR產(chǎn)物 |
最初的5＇RACE系統(tǒng)是按照這個方法進行的，它首先利用SUPERSCRIPT? RNase H RT來合成cDNA第一鏈，然后利用一個快速、有效的方法分離cDNA，通過一個簡單的dC加尾系統(tǒng)來加尾，并使用了一個新穎的錨定引物，該引物帶有脫氧次黃嘌呤，可以最大可能的有效、特異地從dC尾巴引發(fā)擴增發(fā)應(yīng)。錨定引物設(shè)計時還可以選擇提供UDG克隆位點，使獲得5＇RACE產(chǎn)物很方便。
5＇RACE系統(tǒng)版本2保留了原始的5＇RACE系統(tǒng)基本策略和優(yōu)點，同時包括下列一些改進：
1）利用無DNase的RNase H和RNase T1的混合物，來去掉制備好的cDNA中的RNA，以防止帶有的RNA會抑制TdT加尾效果；
2）簡單的5×加尾緩沖液；
3）高度純化的重組TdT，適合于5＇RACE用。另外，重新設(shè)計的擴增引物符合帶有古細菌DNA聚合酶（含有3＇到5＇外切核酸酶活性）的長PCR聚合酶混合物的需要。
由于5＇RACE系統(tǒng)的復(fù)雜性和單個基因特異性引物的使用（和錨定引物一起），使用Taq DNA聚合酶來擴增5＇末端片段長度受到限制，小于1.0kb。然而，最近PCR技術(shù)的進展使得可以PCR擴增的長度超過20kb。這種長PCR技術(shù)是基于在原來的熱穩(wěn)定聚合酶上，額外加有一定限量的帶有3＇到5＇外切核酸酶活性的DNA聚合酶，原來通常使用的是Taq DNA聚合酶，缺少校正功能。
在這兒我們展示將長PCR技術(shù)應(yīng)用到5＇RACE系統(tǒng)中，來分離5.5kb長的人結(jié)節(jié)性腦硬化II（tuberous sclerosis II，TSC-2）mRNA和8.9kb長的腺瘤性結(jié)腸息肉（adenomatous polyposis coli，APC）mRNA的5＇末端，擴增的5＇末端片段要比單獨用Taq DNA聚合酶獲得的片段長。
方法
使用5＇RACE系統(tǒng)版本2 （Cat. No. 18374-058）來擴增TSC-2和APC cDNA的5＇末端，利用TRIZOL?試劑，按照使用說明操作來分離HeLa S3細胞的總RNA，并增加用乙酸銨/乙醇來沉淀總RNA。5＇RACE中使用的引物，包括精簡的錨定引物（Abridged Anchor Primer，AAP）和精簡的通用擴增引物（Abridged Universal Amplification Primer，AUAP），以及TSC-2和APC的GSP如表1所示，引物名字上的數(shù)字代表引物3＇堿基在已發(fā)表序列中的位置，并在AAP序列的5＇端進行一些調(diào)整，所用的引物都由GIBCO BRL合成，脫鹽沉淀，用無菌水稀釋到10mM。PCR用的試劑，包括Taq DNA聚合酶，PCR SUPERMIX，和ELONGASETM擴增系統(tǒng)都來自Life Technologies（即現(xiàn)在的Invitrogen公司）。ELONGASE?酶混合物包括Taq DNA聚合酶和火球菌GB-D（Pyrococcus species GB-D）聚合酶。如果PCR單獨使用Taq DNA聚合酶，5＇RACE系統(tǒng)版本2還帶有用于UDG克隆的引物。
