RNAi基礎(chǔ)知識介紹

Rnai

最近由于RNA 干擾（RNA interference，RNA i）的發(fā)現(xiàn)使反義領(lǐng)域的研究增多。這種自然發(fā)生的現(xiàn)象最早是在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的（1），是序列特異性地使轉(zhuǎn)錄后的基因沉默的有力機(jī)制。由于最近兩年在RNA i領(lǐng)域取得的進(jìn)步，已經(jīng)有許多這方面的綜述發(fā)表（2-4）。RNA 干擾是由長的雙鏈RNA 分子發(fā)動的，該分子可以被Dicer enzyme加工成長度為21-23個核苷酸的RNA 。RNaseIII蛋白被認(rèn)為是作為一個二聚體發(fā)揮作用，它對雙鏈RNA 的兩個鏈都進(jìn)行切割，酶切的產(chǎn)物3'末端互相重疊。然后這種小的干擾RNA 分子（small interferingRNA s，siRNA s）摻入RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA -induced silencing complex，RISC），引導(dǎo)核酸酶降解靶RNA 。

這種保守的生化機(jī)制可用于研究多種模式生物的基因功能，但是它在哺乳動物細(xì)胞中的應(yīng)用受到阻礙，因為長的雙鏈RNA 分子會引起干擾素應(yīng)答。因此Tuschi及其同事表明長度為21nt的siRNA 可以特異性的抑制哺乳動物細(xì)胞基因表達(dá)是一個革命性的突破（5）。這個發(fā)現(xiàn)激發(fā)了大量利用RNA i技術(shù)對哺乳動物細(xì)胞的研究，因為與傳統(tǒng)的反義技術(shù)比，RNA i的性能明顯較高。

有趣的是，除了短雙鏈RNA ，短發(fā)夾RNA （short hairpinRNA ，shRNA ），比如莖環(huán)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過加工后也可以變成siRNA ，從而產(chǎn)生RNA 干擾（6、7）。這使得構(gòu)建表達(dá)干擾RNA 的載體，從而使哺乳動物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)長期沉默成為可能（4、8）。shRNA 可以利用RNA 聚核酶III啟動子轉(zhuǎn)錄，在正常情況下，該啟動子是控制小核RNA （small nuclearRNA ，snRNA ）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的組分H1RNA （11）轉(zhuǎn)錄的。另外一種辦法是兩段短RNA 分子分別用U6啟動子轉(zhuǎn)錄出來（6、12、13）。載體介導(dǎo)的siRNA 表達(dá)使對功能缺失（loss-of-）表型進(jìn)行長期分析成為可能。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)，兩個月后仍可觀察到沉默現(xiàn)象（11）。

另外一種延長siRNA 抑制基因表達(dá)時間的方法是對化學(xué)合成的RNA 進(jìn)行核苷酸修飾。盡管未經(jīng)修飾的短雙鏈RNA 在細(xì)胞培養(yǎng)物或者體內(nèi)的穩(wěn)定性出乎意料的高，然而有些情況下，需要對siRNA 的穩(wěn)定性進(jìn)行進(jìn)一步提高。因此，可以在兩條鏈的末端都引入經(jīng)過修飾的核苷（14）。一個5'端為兩個2'-O-甲基RNA 、3'端為4個甲基化核苷的siRNA 與序列相同但是未經(jīng)修飾的siRNA 比活性相同，但是在細(xì)胞培養(yǎng)物中引起的基因沉默現(xiàn)象的時間延長。然而，增多siRNA 中的甲基化核苷，或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將導(dǎo)致siRNA 活性下降。

RNA 干擾在哺乳動物體內(nèi)的第一個研究是利用快速注射大量生理溶液的方法將一個編碼shRNA 的質(zhì)粒注入老鼠的尾靜脈（15、16）。在大多數(shù)器官中，報道基因（編碼于共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或者轉(zhuǎn)基因小鼠上）的表達(dá)可以被有效地抑制。另外，F(xiàn)as基因被作為肝損傷治療相關(guān)的內(nèi)源靶標(biāo)進(jìn)行了RNA 干擾實(shí)驗（17）。注射siRNA 之后，小鼠肝細(xì)胞中的Fas mRNA 和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保護(hù)小鼠免遭由注射競爭性Fas特異抗體引起的爆發(fā)性肝炎，82%用siRNA 處理的小鼠活過了10天觀察期，而所有的對照小鼠在3天之內(nèi)死亡。

上述研究中采用的高壓導(dǎo)入技術(shù)是一種粗暴的方法，不適于治療用。因此，標(biāo)準(zhǔn)的基因治療所采用的方法被用于RNA 干擾。一個反轉(zhuǎn)錄病毒載體被用于導(dǎo)入siRNA ，以抑制人類胰腺腫瘤細(xì)胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。負(fù)調(diào)控癌細(xì)胞中K-ras基因的表達(dá)使得它們在注入無胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成腫瘤的能力。這項研究還表明siRNA 的高度特異性，因為只有癌基因K-ras被沉默，而與之只有1個堿基對差異的野生型等位基因并沒有被沉默。另外，當(dāng)在紋狀區(qū)注射表達(dá)siRNA 的腺病毒之后，轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中GFP基因的表達(dá)可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通過在小鼠尾靜脈注射重組腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV啟動子和最小的polyA尾的RNA 聚合酶II表達(dá)元件被用于這個實(shí)驗，為設(shè)計組織特異性或者可誘導(dǎo)的siRNA 載體打開了大門。

總的來說，siRNA 的第一個體內(nèi)實(shí)驗已經(jīng)進(jìn)行，其他有重要意義的基因有望于很快作為靶標(biāo)開展研究。至今為止的研究沒有觀察到任何應(yīng)用siRNA 引起的毒性作用，但是在治療人類疾病的臨床試驗開始之前仍需小心，以排除長期使用RNA 干擾引起的嚴(yán)重副作用。因為用siRNA 使基因表達(dá)沉默與傳統(tǒng)的反義技術(shù)相似，研究者將從十多年來反義技術(shù)研究的教訓(xùn)中獲益，比如需要使用合適的對照以證明基因表達(dá)的敲除是特異性的，以及對免疫系統(tǒng)可能引起的意外影響進(jìn)行詳細(xì)分析。

總結(jié)

經(jīng)過長期盛衰沉浮，反義技術(shù)近年來得到越來越多的注意。對能夠提高靶表親和性和生物穩(wěn)定性、降低毒性的修飾核苷的研究取得了重要進(jìn)展。由于大多數(shù)新的DNA類似物不能激活RNaseH，對反義寡核苷酸的設(shè)計需要考慮靶mRNA 是否需要保留，例如，是改變剪接方式，還是降解靶mRNA （這種情況下應(yīng)該使用gapmer技術(shù)）。可以通過有系統(tǒng)的修飾天然核酶或者通過體外選擇技術(shù)獲得具有高催化活性的穩(wěn)定核酶。一些反義寡核苷酸和核酶已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗研究，一個反義藥物已經(jīng)在1998年獲得批準(zhǔn)。一個重要的突破是發(fā)現(xiàn)短的雙鏈RNA 分子可用于哺乳動物細(xì)胞中特異性沉默基因表達(dá)。這個方法與傳統(tǒng)的反義技術(shù)比效率明顯更高，并且一些體內(nèi)實(shí)驗的數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)表。因此，反義技術(shù)有望廣泛應(yīng)用于對未知功能基因的研究、藥物靶標(biāo)的確認(rèn)和治療。

RNA 干擾

RNA 干擾（RNA interference,RNA i）是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA （double-strandedRNA ，dsRNA ）誘發(fā)的、同源mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象。近幾年來RNA i研究取得了突破性進(jìn)展，被《Science》雜志評為2001年的十大科學(xué)進(jìn)展之一，并名列2002年十大科學(xué)進(jìn)展之首。由于使用RNA i技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。