植物組織RNA提取的難點及對策
從植物組織中提取RNA是進行植物分子生物學(xué)方面研究的必要前提。要進行Northern雜交分析，純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR及差示分析等分子生物學(xué)研究，都需要高質(zhì)量的RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進行上述研究的關(guān)鍵所在。
從文獻(xiàn)報道上看，有許多植物就是由于未能有效地分離純化其組織中的RNA，而阻礙了其分子生物學(xué)方面研究的進展。一般認(rèn)為在這些植物組織中，或富含酚類化合物，或富含多糖，或含有某些尚無法確定的次級代謝產(chǎn)物，或RNase的活性較高。在完整的細(xì)胞內(nèi)這些物質(zhì)在空間上與核酸是分離的，但當(dāng)組織被研磨，細(xì)胞破碎后，這些物質(zhì)就會與RNA相互作用。酚類化合物被氧化后會與RNA不可逆地結(jié)合，導(dǎo)致RNA活性喪失及在用苯酚、氯仿抽提時RNA的丟失，或形成不溶性復(fù)合物；而多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀下來；萜類化合物和RNase會分別造成RNA的化學(xué)降解和酶解。
對于這些植物材料，用常規(guī)的RNA提取方法（如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等）難以提取出其RNA。如在用常規(guī)的方法提取芒果果實的RNA時未能成功，結(jié)果分為三種情況：提出的RNA已被降解；RNA的得率很低；得到的RNA不能進行體外翻譯。研究人員認(rèn)為在果實成熟時各種酶的活性增強，其中也包含RNase，不溶性的淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性的多糖，芒果果實細(xì)胞壁中特殊的成份，以及果實中高含量的多酚化合物都是干擾RNA提取的因素。在用苯酚法和胍法提取葡萄果實的RNA時，發(fā)現(xiàn)RNA與某種未知化合物凝聚成不溶性的復(fù)合物，并且這種未知化合物在230nm和270nm處有強的光吸收，從而干擾了RNA紫外吸收的測定。因此能否有效地去除多糖、酚類化合物、RNase和干擾RNA提取的其它代謝產(chǎn)物是提取高質(zhì)量植物RNA成敗的關(guān)鍵。
1. 酚類化合物的干擾及對策
許多植物組織特別是植物的果實（如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等）和樹木類植物中富含酚類化合物。酚類物質(zhì)的含量會隨著植物的生長而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料勻漿時，酚類物質(zhì)會釋放出來，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚㈦S氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)（browning effect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易程度與材料中酚類物質(zhì)的總量之間并無相關(guān)性，因此認(rèn)為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認(rèn)為所謂的“縮合鞣質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類物質(zhì)（如原花色素類物質(zhì)）是影響RNA提取的一類化合物。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然后再將其與RNA分開。
1.1 防止酚類化合物被氧化的方法
還原劑法：
一般在提取緩沖液中加入（-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸來防止酚類物質(zhì)被氧化，有時提取液中（-巰基乙醇的濃度可高達(dá)2%。（-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。在過夜沉淀RNA時加入（-巰基乙醇（終濃度1%）可以防止在此過程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH4）是一種可還原醌的還原劑，用它處理后提取緩沖液的褐色可被消減，醌類化合物可被還原成多酚化合物。
螯合劑法：
螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO-N=基有很強的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強。原花色素類物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使原花色素類物質(zhì)不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時pH值是一個重要的影響因素，在pH8.0以上時PVP結(jié)合多酚的能力會迅速降低。當(dāng)原花色素類物質(zhì)量較大時，單獨使用PVPP無法去除所有的這類化合物，因而需要與其它方法結(jié)合使用。
Tris-硼酸法：
如果提取緩沖液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以與酚類化合物依靠氫鍵形成復(fù)合物，從而抑制了酚類物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合。這一方法十分有效，所以在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris-硼酸濃度過高（>0.2M）則會影響RNA的回收率。
牛血清白蛋白（BSA）法：
原花色素類物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類似于抗原-抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復(fù)合物，減小了原花色素類物質(zhì)與RNA結(jié)合的機會，因此提高了RNA的產(chǎn)量。BSA與PVPP結(jié)合使用提取效果會更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用時要加入肝素以抑制RNase的活性。
丙酮法：
用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料，可以有效地從云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA。
低pH值（pH5.5）的提取緩沖液可以防止酚類化合物的離子化和進一步的氧化。
