RNAi技術在植物基因功能研究中的應用
摘要 RNAi技術是研究基因功能的重要工具。其原理是對某個已知基因，設計誘導其沉默的dsRNA，通過合適手段導入細胞或機體使產生干涉效應的信號分子siRNA，導致基因表達水平下降或完全沉默。通過基因表型變化，鑒定該基因功能。從RNAi的研究背景和作用機制出發，對近年來利用RNAi技術研究植物基因功能的概況、誘導方法和載體作一綜述。
1 RANi的研究背景
1998年，Fire等[1]發現，過去利用正反義RNA阻斷基因表達都是因體外制備的單鏈RNA中污染極少量雙鏈RNA（dsRNA）所引起的，并發現在線蟲中導入dsRNA，mRNA明顯減少，推論存在某種機制特異地破壞降解內源mRNA，導致某個基因沉默，即轉錄后基因沉默（PTGS）。在此情況下，啟動子是活躍的但不能正常積累mRNA。這種現象被稱為RNA干涉（RNAi）。研究表明RNAi現象廣泛存在大多數真核生物中，起到自行監控細胞中異常的mRNA、封閉該基因表達、抵御病毒感染及阻斷轉座子的作用。
RNAi技術是將人工合成或載體表達的小的雙鏈RNA（siRNA）導入真核細胞，促使內源RNA降解，高效特異阻斷體內特定基因的表達，誘使細胞表現出特定基因缺失表型，獲得功能喪失或降低的突變體。RNAi技術具有高度的特異性和高效的干擾活力，是研究基因功能的強有力的工具而被廣泛應用。
2 RNAi的作用機制
對模式生物的研究發現[2]，生物體內外源或內源的dsRNA經酶切，可形成具有5’末端磷酸基、3’末端羥基和2個突出的單鏈核苷酸的信號分子siRNA，誘發RNAi機制。最近研究中還發現，在植物中除了轉錄后水平沉默（PTGS），RNAi也能在基因的轉錄水平（TGS）上發揮作用。
2.1酶的作用
參與RNAi發生的Dicer酶特異識別dsRNA，該酶依賴ATP，能將轉基因和病毒感染等引入的dsRNA，逐步切割成含21-23個核苷酸siRNA，啟動細胞內RNAi反應。RNAi過程的另一種重要的酶是RNA指導的RNA聚合酶（RdRP）。RdRP的作用，使進入細胞內的dsRNA數量呈指數級擴增，RNAi效應得以放大。故少量dsRNA可使大量靶mRNA大幅度下調。
2.2RNAi過程
dsRNA進入細胞后，在Dicer酶作用下被裂解成siRNA，雙鏈解開為單鏈，并和某些蛋白質相結合形成RNA誘導的沉默復合體（RISC）。在ATP的作用下，活化解鏈siRNA指導活化的RISC分裂靶mRNA。另外，在RdRP作用下，以siRNA為模板合成mRNA互補鏈，結果mRNA變成dsRNA，在Dicer酶的作用下被切成siRNA，重復進行分裂靶mRNA。
3 RNAi技術在植物基因功能方面的研究
RNAi被生物學家稱為生物體在基因組水平上的免疫系統，也為植物基因功能的研究提供了新的思路和技術平臺，即利用RNAi技術進行逆向基因分析。針對某個已知的基因，設計可誘導其沉默的雙鏈RNA，通過合適的手段導入細胞或機體，使該基因表達水平下降或完全沉默。觀察基因表型的變化，鑒定基因在基因組中的功能。這僅僅是使表達暫時降低或抑制，基因的信息仍是完整的。
最初在植物中研究RNAi的實驗是使水稻中報告基因GUS沉默，來比較正義鏈、反義鏈及dsRNA誘導RNAi效率的高低。近年來利用RNAi技術在水稻、擬南芥、蕓薹屬、油菜、煙草及棉花上，已經進行了一些基因功能驗證的相關研究[3]。其中研究最深入的是應用RNAi技術進行大規模擬南芥功能基因組的分析，以獲得擬南芥全基因組高質量的基因序列標簽（GST）[4]。
3.1植物體中的RNAi誘導方法
研究表明，在植物體中，信號分子siRNA可通過植物的維管系統運輸。通過韌皮部進行長距離運輸或通過胞間連絲進行細胞與細胞之間的轉運。將目標基因特異性序列以正向和反方分別插入標記基因或內含子的5’端和3’端，再在一端連接一個啟動子，用轉基因技術將反式重復的外源基因導入生物體，誘導表達發夾結構的轉錄產物RNA（iphRNA），能產生穩定遺傳的RNAi現象[5]，其誘導目的基因沉默效率高，適用性廣，應用潛力大。dsRNA或iphRNA能通過以下幾種方法呈遞到植物體內。
3.1.1微彈轟擊法。將dsRNA或含內含子的發夾結構RNA（iphRNA）表達載體顯微注射入植物體內。
3.1.2農桿菌介導法。將帶有能轉錄成ihpRNA的反式重復的外源基因的T-DNA質粒，通過農桿菌介導整合到植物基因組上。
3.1.3病毒誘導基因沉默（VIGS）。目標序列整合入病毒基因序列，通過農桿菌介導轉化ihpRNA表達。
3.2相關的干涉載體
Helliwell及其同事利用Invitrogen公司的Gateway重組克隆技術，構建高通量基因沉默的載體系列pHELLSGATE，
包括全部擬南芥基因組的ihpRNA轉基因系[7]。澳大利亞的CSIRO公司也構建出多種適用于禾本科植物的RNAi載體——pHannibal和pKannibal質粒載體系列[7]。還有用于高通量植物功能基因組構建的載體系列，包括適合組成型表達、誘導型異常表達的GUS或GFP融合蛋白雙元載體，和以煙草花葉病毒為基礎構建的高通量VICS載體系列。新載體的開發加快了植物功能基因組的研究。
3.3RNAi為注釋和認識同源基因及功能提供了快速、高效的鑒定方法
比較接近的物種，可通過比較基因組加快研究進度。利用傳統基因敲除或反義RNA的方法使基因沉默來研究基因家族的功能，往往難以達到理想效果，但應用RNi技術能更好地研究同源基因。Frankish[4]使用RNAi的方法，證實通過合理設計雙鏈RNA，可有效地同時沉默1個基因家族，為多倍體物種的功能基因組學研究指明了方向。
4 RNAi技術在植物功能基因組研究中的應用展望及挑戰
RNAi現象在植物體內能以孟德爾方式遺傳，高度的特異性高效干擾活力，使得RNAi技術在植物學各個研究領域得到廣泛應用。但RNAi技術應用于高通量的植物功能基因組學的研究也有一定的限制。
首先，目的基因序列必須是已知，隨著基因組和EST測序計劃的增加，受序列方面的限制將會減少；其次，dsRNA限制了高通量方法的應用，目前只有少數植物能被成功轉化，穩定表達ihpRNA。
因此，必須改進植物基因干涉載體的轉化方法，加快新載體的開發；第三，并非所有基因都可被沉默，表達水平低的基因RNAi現象不明顯。對多因一效基因或同源性較高的基因家族，干涉會同時作用這些基因，沉默表型難以鑒定；另外，基因被沉默的表型與轉基因時所引起的插入突變表型，有時難以區別。
RNAi作為后基因組時代基因功能驗證和表達調控分析的新技術，有著不可估量的應用價值。可以預見，隨著RNAi技術的不斷完善，植物基因功能的研究和應用將取得更大成果。
5參考文獻
[1] FIRE A，XU S，MONTGOMERY M，KOSTAS S，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391：806-811.
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