RNAi實(shí)驗(yàn)原理、方法和應(yīng)用
近年來(lái)的研究表明，將與mRNA對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）。
一、RNAi的分子機(jī)制
通過(guò)生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據(jù)表明；一個(gè)稱為Dicer的酶，是RNase III家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的3’端都有2個(gè)堿基突出。
在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個(gè)ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過(guò)程。激活的RISC通過(guò)堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個(gè)RISC都包含一個(gè)siRNA和一個(gè)不同于Dicer的RNA酶。
另外，還有研究證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長(zhǎng)的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動(dòng)子失去功能,使其下游基因沉默.
二、如何進(jìn)行RNAi試驗(yàn)(一)siRNA的設(shè)計(jì)
1. 在設(shè)計(jì)RNAi實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以先在以下網(wǎng)站進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選：http://www.genesil.com/business/products/order2.htmhttp://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlhttp://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=453587102.RNAi目標(biāo)序列的選取原則：
(1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。
(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
(3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。3.陰性對(duì)照 一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒(méi)有同源性。4.目前已證實(shí)的siRNA可以在下面的網(wǎng)頁(yè)找到：http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.htmlhttp://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.htmlhttp://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published(二)siRNA的制備 目前為止較為常用的方法有通過(guò)化學(xué)合成，體外轉(zhuǎn)錄，長(zhǎng)片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備siRNA，以及通過(guò)siRNA表達(dá)載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA。
體外制備
1.化學(xué)合成
許多國(guó)外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成3—4對(duì)siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素
2.體外轉(zhuǎn)錄
以DNA Oligo為模版，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNA所能達(dá)到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siRNA。長(zhǎng)期研究。
3.用RNase III 消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA制備siRNA 其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個(gè)缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒(méi)有被消化的dsRNA后，這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過(guò)檢測(cè)和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時(shí)間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過(guò)這種方法的缺點(diǎn)也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因。現(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會(huì)造成影響。最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型不適用于：長(zhǎng)時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療體內(nèi)表達(dá) 前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采用siRNA表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA。
4. siRNA表達(dá)載體 多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動(dòng)子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。之所以采用RNA pol III啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過(guò)添加一串（3到6個(gè)）U來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的pol III 啟動(dòng)子下游。由于涉及到克隆，這個(gè)過(guò)程需要幾周甚至數(shù)月的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過(guò)測(cè)序以保證克隆的序列是正確的。 siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長(zhǎng)期研究——帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。病毒載體也可用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。最適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默。不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）。
5. siRNA表達(dá)框架 siRNA表達(dá)框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，包括一個(gè)RNA pol III啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個(gè)RNA pol III終止位點(diǎn)，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測(cè)序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時(shí)間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來(lái)篩選在特定的研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過(guò)SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長(zhǎng)效抑制的研究。這個(gè)方法的主要缺點(diǎn)是
①PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中
②不能進(jìn)行序列測(cè)定，PCR和DNA合成時(shí)可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子不適用于：長(zhǎng)期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）
(三)siRNA的轉(zhuǎn)染 將制備好的siRNA，siRNA表達(dá)載體或表達(dá)框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞中的方法主要有以下幾種：
1.磷酸鈣共沉淀 將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過(guò)胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗x最優(yōu)條件十分之一個(gè)pH都會(huì)導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。
2.電穿孔法 電穿孔通過(guò)將細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場(chǎng)中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^(guò)高的場(chǎng)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。一般，成功的電穿孔過(guò)程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene
帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過(guò)使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。4.機(jī)械法 轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機(jī)械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolistic particle）。顯微注射使用一根細(xì)針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。基因槍使用高壓microprojectile將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。5.陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑 在優(yōu)化條件下將陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑加入水中時(shí)，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱，一個(gè)約5kb的質(zhì)粒會(huì)結(jié)合2-4個(gè)脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會(huì)被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞。現(xiàn)存對(duì)DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來(lái)源于內(nèi)吞體和溶酶體。
為了達(dá)到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要注意以下幾點(diǎn)：
1.純化siRNA 在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過(guò)15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。
2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過(guò)的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性 通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨時(shí)間明顯下降。
4.避免使用抗生素
Ambion公司推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時(shí)期間避免使用抗生素。抗生素會(huì)在穿透的細(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)需要無(wú)血清的條件。這種情況下，可同時(shí)用正常培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。
5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑 針對(duì)siRNA制備方法以及靶細(xì)胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對(duì)siRNA實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。
6.通過(guò)合適的陽(yáng)性對(duì)照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測(cè)條件
對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽(yáng)性對(duì)照。將不同濃度的陽(yáng)性對(duì)照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞（同樣適合實(shí)驗(yàn)靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)對(duì)照蛋白或mRNA相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過(guò)多的siRNA將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。7.通過(guò)標(biāo)記siRNA來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 熒光標(biāo)記的siRNA能用來(lái)分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（配合標(biāo)記抗體）來(lái)追蹤轉(zhuǎn)染過(guò)程中導(dǎo)入了siRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來(lái)。
三、RNAi的應(yīng)用前景1. 研究基因功能的新工具
已有研究表明RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中滅活或降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。線蟲和果蠅的全部基因組序列已測(cè)試完畢，發(fā)現(xiàn)大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進(jìn)對(duì)這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近來(lái)RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。2. 研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑
聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系，Clemensy等應(yīng)用RNAi研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑,取得了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路完全一致的結(jié)果,在此基礎(chǔ)上分析了DSH3PX1與DACK之間的關(guān)系, 證實(shí)了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，克服了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中重組蛋白特異性聚集和轉(zhuǎn)染效率不高的缺點(diǎn)， 因此認(rèn)為RNAi技術(shù)將可能成為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑。3.開展基因治療的新策略
RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)，防止自私基因序列過(guò)量增殖等作用，因此可以利用RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生抗病毒的植物和動(dòng)物，并可利用不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段相應(yīng)的dsRNA抵抗多種病毒。 腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng), 而RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性, 設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn)，也可以同時(shí)注射多種dsRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。 盡管目前RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用還處于探索階段，但它在斑馬魚和老鼠等脊椎動(dòng)物中的成功應(yīng)用預(yù)示著RNAi將成為基因治療中重要的組成部分，人工合成的dsRNA寡聚藥物的開發(fā)將可能成為極具發(fā)展前途的新興產(chǎn)業(yè)。
RNAi技術(shù)在病毒性疾病和腫瘤治療中的應(yīng)用前景
摘要 RNA干擾是內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA誘發(fā)的mRNA水平上的基因沉默機(jī)制，具有高度特異性。21 nt干擾性小RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以誘導(dǎo)強(qiáng)有力的特異性RNAi作用，這一突破性研究進(jìn)展開創(chuàng)了人類疾病治療的新天地，RNAi 技術(shù)用于人類疾病治療已受到極大關(guān)注，尤其在AIDS、乙肝和丙肝等病毒感染性疾病和腫瘤治療中的應(yīng)用研究最為活躍和深入，并取得了令人鼓舞的成果。本文對(duì)siRNA的設(shè)計(jì)、制備，及其在病毒性疾病和腫瘤治療中的研究進(jìn)展作一綜述。 關(guān)鍵詞：siRNA RNAi 腫瘤治療 HIV 病毒性肝炎 RNAi （RNA interference，RNAi）是高度特異的在mRNA水平上的基因沉默機(jī)制，由內(nèi)源性或外源性dsRNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)。dsRNA 在細(xì)胞內(nèi)被切割成21-25nt 干擾性小RNA（small interfering RNA，siRNA）， siRNA介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶mRNA分子，從而導(dǎo)致該基因不表達(dá)[1]。RNAi發(fā)現(xiàn)僅短短5年的時(shí)間，由于其高效性和高度特異性，RNAi 成為頗為理想的細(xì)胞水平基因敲除工具，并迅速成為后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)研究中不可或缺的重要手段。然而，由于長(zhǎng)的dsRNA（38-1000bp）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生非特異的基因表達(dá)抑制，使得RNAi 技術(shù)用于哺乳動(dòng)物中的研究相對(duì)滯后。直至2001年，Tuschl研究組通過(guò)采取21 nt siRNA 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)了強(qiáng)有力的特異性RNA干擾作用[3]，這一突破性研究進(jìn)展開創(chuàng)了人類疾病治療的新天地，在AIDS、乙肝和丙肝等病毒感染性疾病和腫瘤治療中的應(yīng)用研究最為活躍和深入，并取得了令人鼓舞的成果。本文對(duì)siRNA的設(shè)計(jì)、制備，以及在病毒性疾病和腫瘤治療中的研究進(jìn)展做一綜述。
siRNA的設(shè)計(jì)、制備
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引發(fā)特異的基因沉默最有效的siRNA是21 nt siRNA[3]，其中19個(gè)堿基互補(bǔ)，兩邊3? 端各有2個(gè)堿基突出（通常是AA或UU）。基因抑制的有效性關(guān)鍵在于siRNA靶基因序列片段的選擇，然而，目前為止人們并不知道m(xù)RNA的哪一個(gè)部位對(duì)siRNA更敏感。通常隨機(jī)選擇3-4個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)siRNA，然后根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出最為有效的siRNA。考慮到mRNA 5? 端非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs）通常有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)控蛋白與目的mRNA UTR區(qū)結(jié)合后可能會(huì)影響RISC復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)與mRNA結(jié)合降低抑制效果，通常人們避開此區(qū)域設(shè)計(jì)siRNA，但也有研究者持相反態(tài)度。 選出合適的靶序列后要同Genebank中的編碼序列進(jìn)行blast 序列分析是非常必要的，這可以避免與無(wú)關(guān)的mRNA序列同源[4]。目前有多種在線siRNA設(shè)計(jì)軟件可供使用，詳細(xì)情況請(qǐng)搜索相關(guān)網(wǎng)站（www.dharmacon.com, www.qiagen.com, www.ambion.com, ）。
化學(xué)合成法制備siRNA是目前最常用的方法，Dharmacon、QIAGEN 、Ambion等公司均可以提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA，但費(fèi)用昂貴。其他體外制備siRNA的方法還包括體外轉(zhuǎn)錄法和Rnase III（如Silencer siRNA Construction Kit，Ambion公司） 或Dicer 酶消化dsRNA法[5]。體外制備的siRNA需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，在不同細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率存在較大差異，在原代細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率低，轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)后作用時(shí)間較短，不能持久抑制基因表達(dá)。針對(duì)以上不足，結(jié)合過(guò)去20多年基因治療的經(jīng)驗(yàn)，人們構(gòu)建了各種siRNA 表達(dá)載體或病毒載體，siRNA通過(guò)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)的DNA模板轉(zhuǎn)錄而獲得，在細(xì)胞內(nèi)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的小RNA（short hairpin RNA, shRNA）。siRNA病毒載體的應(yīng)用研究是目前研究的熱點(diǎn)。目前RNAi常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和腺病毒載體[6，7]。
RNAi 在抗病毒感染中的應(yīng)用前景
1. RNAi 技術(shù)用于抗HIV治療 2001年Tuschl研究組的突破性研究開創(chuàng)了RNAi技術(shù)治療人類疾病的新途徑，siRNA迅速成為治療HIV的新武器。美國(guó)費(fèi)城的Thomas Jefferson 大學(xué)生化及分子藥理研究所Roger J. Pomerantz博士指出：將這項(xiàng)新穎的技術(shù)應(yīng)用于人類疾病的治療上可能有莫大的潛力。在AIDS的治療上，RNA干擾可能成為對(duì)抗HIV病毒感染、復(fù)制的最有利方式。人們針對(duì)HIV生活周期的不同階段設(shè)計(jì)了多種siRNA，針對(duì)HIV病毒gag、tat、rev、nef等基因的siRNA可用以控制病毒復(fù)制，針對(duì)宿主細(xì)胞的表面HIV受體基因的siRNA可用以控制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，抑制病毒的感染過(guò)程[8]。
1.1 針對(duì)HIV基因組RNA的siRNA Jacque等針對(duì)HIV病毒基因組的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeat ,LTR)、病毒vif和nef基因，設(shè)計(jì)合成了siRNA。他們將siRNA和HIV前病毒DNA共同轉(zhuǎn)染CD4受體陽(yáng)性的Hela細(xì)胞，病毒感染陽(yáng)性細(xì)胞的比率同對(duì)照組相比降低了95%以上。諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主Philip Sharp博士研究組設(shè)計(jì)合成了針對(duì)HIV gag 基因的anti-gag siRNA。研究證實(shí)針對(duì)病毒基因組的gag區(qū)域的siRNA可以有效的將病毒的基因“沉默”，抑制HIV病毒的復(fù)制能力[9]。Bauer 研究組通過(guò)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)anti-rev siRNA，可明顯降低HIV復(fù)制水平，作用持續(xù)時(shí)間達(dá)數(shù)天之久[10]。在體外細(xì)胞株培養(yǎng)條件下，人們利用RNAi技術(shù)成功的控制HIV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力，然而，將該項(xiàng)技術(shù)用于臨床治療尚有一定距離。首先，siRNA轉(zhuǎn)染到原代T淋巴細(xì)胞比較困難是anti-HIV siRNA在臨床應(yīng)用上的一大障礙。其次，RNAi具有高度特異性，靶序列上一個(gè)堿基的差異即可導(dǎo)致抑制效果明顯不同，而HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的錯(cuò)配率較高（每個(gè)復(fù)制周期可達(dá)1/1000nt），可能會(huì)迅速產(chǎn)生病毒突變株逃避siRNA的抑制作用。再者，不同個(gè)體甚至同一個(gè)體內(nèi)的HIV病毒基因組呈現(xiàn)序列復(fù)雜多樣性，給siRNA的設(shè)計(jì)帶來(lái)困難。
1.2 針對(duì)宿主細(xì)胞HIV受體的siRNA 由于HIV病毒基因組的復(fù)雜多樣性和易突變性，單獨(dú)針對(duì)某一病毒基因的siRNA可能無(wú)法達(dá)到令人滿意的抑制病毒復(fù)制的效果，采取針對(duì)宿主細(xì)胞HIV受體的siRNA以阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)也許更具實(shí)用價(jià)值。CD4是HIV病毒與之結(jié)合并進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)的主要受體，Philip Sharp博士研究組發(fā)現(xiàn)，針對(duì)宿主細(xì)胞受體CD4的anti- CD4 siRNA可以有效抑制HIV病毒的感染能力，并進(jìn)而影響其復(fù)制水平[10]。然而，CD4是人體正常免疫功能不可缺少的分子，它的表達(dá)抑制勢(shì)必影響細(xì)胞免疫功能。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞共同受體CCR5的突變可以有效的保護(hù)細(xì)胞免受HIV-1的攻擊，而不影響正常的免疫功能。由此可以設(shè)想針對(duì)CCR5、CCR4等共同受體的siRNA或許具有更大的意義。此外，我們可以針對(duì)HIV感染和復(fù)制的不同階段設(shè)計(jì)多種siRNA，多種siRNA聯(lián)合應(yīng)用很可能增強(qiáng)病毒抑制效果，也可以同其他抗HIV的藥物合用。
2．RNAi技術(shù)用于治療其他病毒性疾病的研究 RNAi技術(shù)除用于抗HIV研究以外，還用于抗其他多種病毒的探索。它們包括乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒（influenza virus）、脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus）等[11,12]。以上研究均取得了另人欣喜的體外病毒抑制作用，但體內(nèi)清除病毒的效果尚須在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)一步驗(yàn)證。RNAi技術(shù)可能會(huì)給病毒治療帶來(lái)一場(chǎng)革命，但真正用于抗病毒治療還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
RNAi 在抗腫瘤治療中的應(yīng)用前景
1.RNAi用于抑制癌基因表達(dá)
原癌基因是細(xì)胞基因組中的正常組成成分，在自然狀態(tài)下無(wú)致癌作用，主要作用是通過(guò)編碼生長(zhǎng)因子、受體和細(xì)胞內(nèi)信息傳遞物質(zhì)調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和分化。原癌基因的活化主要包括點(diǎn)突變、插入突變、基因擴(kuò)增和染色體重排。以上各種類型的活化的癌基因的mRNA均可以采取RNAi 技術(shù)得到抑制，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
1.1 RNAi 技術(shù)用于敲除點(diǎn)突變激活的癌基因 RNAi 技術(shù)是敲除點(diǎn)突變激活的癌基因的理想武器。K- ras 基因成為第一個(gè)采用RNAi 技術(shù)敲除的癌基因。ras基因是目前已知在人類腫瘤中最普遍呈活化狀態(tài)的致癌基因，此基因的突變現(xiàn)象存在于30-50%的腫瘤組織中，在胰腺癌可達(dá)85%。突變的ras 基因與正常細(xì)胞中的野生型ras 基因通常只有一個(gè)堿基的不同，但由于RNAi 的高度特異性，可以針對(duì)腫瘤細(xì)胞中突變的ras產(chǎn)生抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞中的野生型ras不產(chǎn)生抑制作用。Agami研究組采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體shRNA表達(dá)系統(tǒng)不僅特異性地在體外抑制了CAPAN-1胰腺癌細(xì)胞內(nèi)的K- ras 基因的表達(dá)，也成功的抑制了裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)[13]。
1.2 RNAi 技術(shù)用于抑制基因擴(kuò)增 基因擴(kuò)增是指原癌基因通過(guò)某種機(jī)制在原來(lái)染色體上復(fù)制出多個(gè)拷貝數(shù)，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物異常增多，細(xì)胞增殖。EGFR（erbB1）在乳腺癌和肺癌等多種上皮性腫瘤中發(fā)生基因擴(kuò)增，在腫瘤發(fā)生中起重要作用。德國(guó)Jovin研究組通過(guò)化學(xué)合成的anti-erbB1 siRNA成功的抑制了A431細(xì)胞內(nèi)erbB1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加和腫瘤增殖減弱[14]。
1.3 RNAi 技術(shù)用于抑制融合基因表達(dá)
染色體重排是指癌基因從所在染色體的正常位置上易位至另一個(gè)染色體的某一位置上，使起調(diào)控發(fā)生改變轉(zhuǎn)為激活狀態(tài)，產(chǎn)生異常基因產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。BCR/ABL融合基因是定位于人9號(hào)染色體9q34上的C-ABL基因和22號(hào)染色體22q11 上的BCR基因發(fā)生t（9：22）易位，使相應(yīng)的無(wú)關(guān)的基因發(fā)生融合而形成的，它是Ph 染色體的分子基礎(chǔ)，在慢性粒細(xì)胞性白血病（CML）發(fā)病中起到重要作用。Borkhardt等采用RNAi 技術(shù)成功的抑制了K562白血病細(xì)胞中的BCR/ABL融合基因mRNA的表達(dá)[15]。
2.RNAi用于抑制其他與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)
腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中除癌基因激活外，還涉及到多種形式的基因改變。bcl-2 是與血液系統(tǒng)惡性腫瘤密切相關(guān)的抗凋亡基因，可以阻遏化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡。raf-1和白血病的發(fā)生和耐藥性也有密切聯(lián)系。抑制bcl-2 和raf-1 mRNA的表達(dá)可以抑制白血病細(xì)胞的增殖[[16]。抑制腫瘤血管的生成是腫瘤治療的又一策略，anti- VEGF siRNA可以特異性的抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)[17]。腫瘤的耐藥性和多藥耐藥基因（multidrug resistance，MDR）的表達(dá)有關(guān)，通過(guò)anti- MDR siRNA可以抑制細(xì)胞的耐藥產(chǎn)生[18]。
如何在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶基因siRNA轉(zhuǎn)移到所有腫瘤細(xì)胞并穩(wěn)定持久的抑制癌基的表達(dá)是RNAi技術(shù)治療腫瘤的關(guān)鍵。此外，從目前RNAi的研究現(xiàn)狀來(lái)看，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，RNAi并不能完全阻斷基因的表達(dá)，尤其是異常高表達(dá)的基因[3], 這也將影響對(duì)腫瘤的治療療效。盡管如此，但RNAi的高效特異性抑制癌基因表達(dá)以及明顯優(yōu)于反義核酸的效果的特征顯示: RNAi將是一項(xiàng)令人不可忽視的抗腫瘤新技術(shù)。
2002年12月20日, Small RNA & RNAi 被Science雜志評(píng)為年度十大科技成就之首，Nature雜志亦將Small RNA評(píng)為年度重大科技成果之一。RNA研究的突破性進(jìn)展，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近20年來(lái)，可與人類基因組計(jì)劃（human genomics program，HGP）相提并論的最重大成果之一。RNAi最主要的功能在于可以調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級(jí)生命活動(dòng)。人們對(duì)小RNA分子的深入研究必將大大推進(jìn)基因功能的研究，更為各種病毒性疾病和腫瘤等疾病的根治，開辟新的治療途徑。Small RNA與RNAi的研究與應(yīng)用，具有極其重要的理論和實(shí)際意義，它必將對(duì)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
