RNAi技術(shù)歷史背景、作用機(jī)理與路線圖
一、RNAi的概念與產(chǎn)生的歷史背景
隨著分子 生物 學(xué)的飛速發(fā)展，一些新分子 生物 學(xué)技術(shù)正在不斷孕育和產(chǎn)生，RNAi技術(shù)成為新的分子生物學(xué)研究熱點，獨占分子生物學(xué)新技術(shù)的鰲頭。
近年來研究表明，一些小的雙鏈RNA（dsRNA）可以高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，促使mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，即稱為RNA干擾（RNA interference, RNAi，也稱RNA干預(yù)或干涉或沉默）。
其實，它是生物體內(nèi)抵御外在感染的一種重要保護(hù)機(jī)制。由于可以作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具。自1998年被發(fā)現(xiàn)以來，在其作用機(jī)制研究、應(yīng)用于生物基因組中特定基因功能的研究、封閉和阻斷病原體基因表達(dá)等方面，取得了重要進(jìn)展，顯示出良好的應(yīng)用前景。
RNAi技術(shù)正在功能基因組學(xué)領(lǐng)域掀起一場真正的深刻革命，并將徹底改變這個領(lǐng)域的研究步伐。
為此，《Science》雜志和美國科學(xué)促進(jìn)會將RNAi技術(shù)評為2002年度最重大的十大科學(xué)成就之首，成為2002年度最耀眼的明星，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近20年來，可與HGP相提并論的最重大成果之一。
認(rèn)為該項技術(shù)將對治療腫瘤、愛滋病、肝炎等多種威脅人類健康的重大疾病帶來希望。
二、RNAi的作用機(jī)理
RNAi最主要的作用是一小段（大約21-23bp）的雙鏈RNA分子（double-strainded RNA,dsRNA）它介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)序列特異性基因表達(dá)阻斷或封閉，也就是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）,從而起到控制細(xì)胞的各種高級生命活動。
1. RNAi的作用水平
RNAi是在多重水平上發(fā)揮作用的。最先在華麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，dsRNA所誘導(dǎo)的基因沉默在轉(zhuǎn)錄后水平，因為dsRNA導(dǎo)致了相應(yīng)RNA（mRNA）的降解，而基因啟動子和內(nèi)含子序列作為基因沉默觸發(fā)物則無效。后來在植物中也發(fā)現(xiàn)，RNAi引起的基因沉默也是在轉(zhuǎn)錄后水平。
除此轉(zhuǎn)錄后水平降解mRNA的機(jī)制外，RNAi還通過其他機(jī)制來影響基因表達(dá)。在植物中，dsRNA導(dǎo)致基因組中與沉默觸發(fā)物同源序列的甲基化；如果與沉默觸發(fā)物與啟動子序列相同，則引起轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默 。而另外的研究還發(fā)現(xiàn)，在華麗新小桿線蟲中，RNAi裝置中，內(nèi)源性編碼的誘導(dǎo)劑，是在蛋白質(zhì)合成水平發(fā)揮作用的。
2. RNAi的作用的基本過程
第一步：起始步 沉默觸發(fā)物被裂解，產(chǎn)生小干擾性RNA（small interfering RNAs，siRNAs）。研究表明，果蠅胚胎提取物就有將長鏈dsRNA底物裂解為長度在約22bp小片段的活性。這些siRNAs是雙鏈的，有磷酸化的5ˊ端。這一過程，可能與Rnase Ⅲ家族的功能有關(guān)。
該家族中有一類已被命名為Dicer酶，含2個催化結(jié)構(gòu)域、1個螺旋酶結(jié)構(gòu)域和1個PAZ基序。遺傳學(xué)研究表明，Dicer酶結(jié)構(gòu)在多種生物體之間比較保守。
第二步：效應(yīng)步 siRNAs與多種亞單位形成復(fù)合物—RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC），然后以RISC的方式降解單鏈的靶mRNA。在RISC中，這種大小約22bp的siRNAs所起的作用，是以堿基配對的原則，識別與dsRNA相同序列的靶mRNA，引導(dǎo)復(fù)合物中的RNA降解酶RNase，確保對特定的序列的靶mRNA進(jìn)行降解。
第三步：沉默效應(yīng)的放大和擴(kuò)散 在華麗新小桿線蟲中，RNAi能夠擴(kuò)散到整個蟲體，即使只有少量的觸發(fā)物dsRNA；在植物中也發(fā)現(xiàn)了相似的情況，沉默效應(yīng)擴(kuò)散到整株植物，并可轉(zhuǎn)移到嫁接的幼芽。
研究發(fā)現(xiàn)，西紅柿中RNA指導(dǎo)的RNA 聚合酶 （RdRP）與RNAi的擴(kuò)散有關(guān)；而華麗新小桿線蟲和植物中dsRNA誘導(dǎo)的基因沉默所需要參與的蛋白質(zhì)，在序列上與西紅柿的這種RdRP很相似；在其他生物體中，起RdRP作用的分別可能是：擬南芥屬—SDE1/SGS2，脈孢菌屬—QDE-1，胚系華麗新小桿線蟲—EGO-1，華麗新小桿線蟲成蟲—RRF-1/RDE-9；而病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS），則是螺旋酶。有學(xué)者認(rèn)為，沉默效應(yīng)的放大和擴(kuò)散，是RdRP激發(fā)了另外的dsRNA合成。
