原位雜交組織化學常用試劑及處理
一、雜交前準備
（一）DEPC水是經DEPC處理過的滅菌蒸餾水。
DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可滅活各種蛋白質，是RNA酶的強抑制劑。原位雜交在雜交及其以前的各步處理中，所有液體試劑都應經DEPC處理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待處理水（蒸餾水等）中，經猛烈振搖后，于室溫靜止數小時，然后高壓滅菌，以除去降解DEPC（DEPC分解為CO2 和乙醇）。有些試劑可直接加入DEPC，終濃度一般為0.1%～0.4%，原則上在雜交及其以前的步驟中，所有液體試劑均需用DEPC處理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀釋。此外，接觸標本以及標本有關的空中的洗滌也需DEPC水洗滌。
注意：①DEPC是一種潛在的致癌物質，在操作中應盡量在通風的條件下進行，并避免接觸皮膚。②含有Tris緩沖液的溶液中，不能加入DEPC。
（二）載玻片的處理
組織原位雜交，常在載玻片上進行，故載玻片的洗滌至關重要，必須保持清潔，并且不能有任何核酸的污染。處理方法如下：
（1）先經洗衣粉浸泡過夜，次日自來水沖洗后，泡酸數小時以上，取出后再用流水沖洗，雙蒸水沖洗2～3次，置160℃以上烤箱中燒烤4h以上，或經15磅高壓滅菌20min。經以上處理可清除載片上的核酸酶。
（2）HCl處理法
（三）硅化
【方法１】（1）將一扎新的蓋玻片散開，在通風條件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷卻后,倒掉鹽酸。
（2）用去離子水沉漂洗玻片，豎放在架子上自然干燥。
（3）硅化蓋玻片：通風條件下，將單塊的蓋玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC）液中浸幾下，豎入在架子上干燥。
（4）收集干燥的蓋玻片于一可耐熱的petri氏盤（或培養皿）中，用去離子水漂洗數次，徹底清洗。
（5）用鋁箔將裝有蓋玻片的培養皿包好，于180℃烘烤4h過夜。取出待冷至室溫后，即可進行后續處理。
附：2%DMDC
配制：按比例兩者充分混勻，靜止待氣泡消失即可使用。
用途：硅化玻片（載片、蓋片均可）。
【方法2】將經過洗凈的玻璃蓋片分散開放在一金屬網中，并將該網放入一接有真空泵的干燥器中。同時，在干燥器中放一盛有約1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小燒杯。蓋好干燥器（確保密閉），抽真空約5min，然后讓空氣沖入。取出盛有蓋片的金屬網架，用錫箔紙包埋，于250℃以上烘烤4h以上，最好過夜。冷卻后備用。
本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃燒干。
【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法
【方法4】
（1）49ml氯仿與1mg二甲二氯硅浣（DMDC）配液；
（2）倒入每個擬硅化的試管或離心管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水沖洗；
（3）玻璃器皿使用前位于180℃以上烘烤2h以上，塑料器皿應于60℃烘烤過夜。
注意：DMDC有毒且高度揮發，應于通風環境操作并戴口罩、手套，避免接觸皮膚或吸入。
（四）載片的包被（粘貼）
１．沾附劑
（1）多聚賴氨酸(poly-L-Lycine,PLL)
儲備液（0～5%）
按上述劑量充分混合，即為濃度為5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分裝成1ml的包裝，-20℃存放。該液為儲備液，可反復凍融，無明顯影響。用前充分混合。
工作液（0.01%）：
充分混合，靜止待氣泡消失。
（2）明膠液
配法：先稱取明膠溶于500～800ml DEPC水中，加熱攪拌助溶，待明膠完全溶解以后，加入甲明礬溶解后即可使用。注意，包被玻片時，明膠液溫度最好保持在60℃左右，效果最佳。方法同PLL包被玻片。
2．多聚賴氨酸包被玻片的制備方法（其它包被劑相同）
（1）將事先準備好的經160℃以上烘烤，并冷卻至室溫的玻片（載片或蓋片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸幾下，分散開豎放在架子上，于空氣中自然干燥，4℃備用。注意：①浸蘸時，務必使整個玻片完全浸于液體中，否則，包被不完全會產生標本脫落現象；②干燥過程中注意避免塵埃污染；③按上法處理的玻片通常可存放在一定時間（室溫1月以上，4℃更長），但仍建議盡早使用。
（2）多聚賴氨酸1mg溶于10ml滅菌的去離子水或1mmol/L的Tris-HCl緩沖液中（pH7.0），將其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。該法包被的玻片可用于細胞涂片和切片。
（3）將PLL工作液滴至蓋玻片上5μl/片，用另一蓋玻片以推血涂片方法推片，或用另一蓋玻片緊貼于其上，相互磨擦以使兩蓋玻片相對的一面涂布上PLL。該法制備的玻片，只有一面是包被有PLL，故制備時，待其晾干后，應作好記號，然后保存后備用。
多聚賴氨酸可用于多種核酸雜交，方法簡單，結果可靠，有許多其它方法不可比擬的優點。配制好的液體可存放于4℃或室溫，但時間過長會解聚而失效，故建議使用時盡量新鮮配制。
（4）Vectabond粘附劑
該試劑是Vector公司新近推出的一種新型粘附劑。它與其它粘附劑的主要區別是：一般的粘附劑是通過物理性覆蓋在玻片表面，天長日久，可能由于包被不完全或局部脫落而致切片等標本易于脫落。而Vectabond試劑是通過化學性作用，改變玻璃表面的分子結構，使標本貼附牢固，不易脫落，且保持時間長久，耗量小，價格便宜，一個包裝7ml可配成350ml工作液使用。操作程序：
標本（鋪片、切片等）→丙酮（5min）→Vectabond試劑工作液（5min）→dH2 O(2×5min)→干燥（溫箱，數小時過夜）→用鋁箔包好，室溫備用。
注意：制備和保存過程中避免污染。
經上述處理的載玻片一般可存放半年以上（4℃可更長）。
（五）硅魚精子DNA的制備
（1）在50ml滅菌聚乙烯管中加入1g鮭精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；
（2）加入2.5ml 2mol/L HCl，室溫放置，DNA形成白色沉淀，充分振搖至沉淀物相互纏繞在一起，用吸頭尖端使之形成一球團狀（2～3min）；
（3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。搖動小管使DNA懸浮、溶解，將小管置50℃15min助溶；
（4）用DEPC水將混合物稀釋至175ml（總體積），充分混合，注意確保管內已無顆粒狀；
（5）加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH7.4）；
（6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH為7.0～7.5；
（7）用無菌微孔濾膜過濾液體，去除顆粒。260nm測定溶液的OD值，方法是：取20μl DNA液混合于980μl水中，混勻后測定，吸收值乘以50即為DNA濃度（μg/ml）；
（8）制備好的DNA液儲于-20℃備用，用前取出凍融后煮沸。
二、關于探針的標記
（一）cRNA探針的同位素標記
1．標記液（轉錄標記）
2．轉錄緩沖液
※：用地高辛或生物素標記時，用UTP替代。
3．標記終止液
4．標記探針水解液
先用dH2 O懸浮探針，再加入后兩種試劑，輕輕振搖混合，于60℃條件下反應。
5．探針水解時間
注：LO －探針初始長度（kb）
Lf －探針的終長度（kb）
K－0.11kb/min
6．探針水解終止液
每次加入充分混合，臨用前配。
7．探針沉淀液
每次加入，充分混合，新鮮配制。
（二）寡聚核苷酸3’端標記（cRNA探針）
1．標記反應液
2．終止液：0.2mol/L EDTA
3.探針沉淀液
（三）cRNA探針非同位素標記（地高辛及生物素）
1．標記液
△：生物素標記時為10mmol/L的生物素-11-UTP
※：為檢測標記率而加。
2．轉錄標記終止液
（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛標記法
（2）生物素標記終止液：
（四）DNA探針標記常用試劑的配制
（1）10 ×缺口平移緩沖液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2 ;100mmol/Lβ-巰基乙醇、1mg/ml BSA。
（2）缺口平移反應終止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。
（3）DNaseⅠ:干粉狀DNaseⅠ(2000～3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10μl分裝，-20℃保存一年。
（4）10×DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）緩沖液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg－Cl2 ;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。
（5）10×激酶緩沖液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2 ;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L亞精胺。
（6）10×隨機引物標記緩沖液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2 ;10mmol/L β-巰基乙醇；500μg/ml BSA。
（7）1×加尾緩沖液：100mmol/L二甲胂化鉀，pH7.0,1mmol/l CoCl2 0.2mmol/L DTT。
（8）1mol/L MgCl2 :MgCl2 47.60g溶于500ml水中，100ml分裝，高壓滅菌，室溫保存。
（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，調pH至8.0，加水至500ml，100ml分裝，高壓滅菌，室溫保存。
（10）4mol/L醋酸鈉：取無水醋酸鈉82g溶于200ml水中，用醋酸調pH至6.5，加水至250ml，高壓滅菌，或0.45μm膜過濾，室溫保存。
（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸鈉）溶于50ml水中，加水至100ml，分裝后室溫保存。
（12）20×SSC：取NaCl 175.3g;檸檬酸鈉88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH調pH至7.0；高壓滅菌，室溫保存。
（13）無菌水：100ml去離子水或雙蒸水，分裝，高壓滅菌，室溫保存，開瓶后僅限一周使用。
（14）10×激酶緩沖液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2 ;50mmol/l DTT;10mmol/L亞精胺（非必需）。
（15）T4 多聚核苷酸激酶：10u/μl，保存在甘油中，-20℃。
（16）TE緩沖液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L貯存液)，1.0mmol/l ED－TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)貯存液，加水至100ml，室溫保存。
（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加濃HCl 75ml ,邊加邊緩慢攪動，至pH7.4,于加水至1000ml。
（18）1mol/L DTT(二硫蘇糖醇)：3.0g DTT溶于20ml水中，分裝，于-20℃貯存。
（19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二鈉鹽）：在燒杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTA－Na2 ?2H2 O,充分混勻，加10mol/l NaOH調pH至8.0,加水至500ml。
（20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混勻，再加水至500ml。
（21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。
（22）1mol/L HCl：加86.2ml濃鹽酸至913.8ml水中。
（23）1mol/L CaCl2 ：147g CaCl2 ：2H2 O,溶于1000ml水中,高壓滅菌,室溫保存。
三、固定劑
進行原位雜交的組織或細胞標本常需經固定處理。盡管許多化學物質對組織/細胞有固定作用，但核酸原位雜交的理想固定液應具備如下特點：①能很好地保持組織細胞的狀態；②對核酸無抽提、修飾及降解作用；③不改變被檢核酸分子在組織細胞內的定位；④對核酸及探針的雜交過程無阻礙作用；⑤固定液本身對雜交信號無遮蔽、掩蓋作用，如不使本底增加等；⑥理化性質穩定、價格低廉。
1．4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）
配法：稱取40g PFA溶于裝有500ml DEPC水的玻璃容器（燒杯或燒瓶）中，持續加熱磁力攪拌至60～65℃，使成乳白色懸液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮狀（滴加），再加入約500ml 2×PBS※ ，充分混勻（在冰浴或冷水浴中），可再檢測一下pH，過濾后定容至1000ml，室溫或4℃保存備用。
注意：①配制時應在通風條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩），因PFA有較強的固定作用及毒性，對粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；②加熱時，溫度不宜過高，常為60～65℃，否則，PFA降解失效；③配制好的PFA雖可存放一定時間，但過久的液體，固定效果下降，建議盡早使用。
附：固定液用PBS的配制：
配法：按上述比例稱取試劑，溶于DEPC水（也可用蒸餾水加DEPC）500～800ml中，過濾后，加水定容至1000ml，高壓滅菌。通常配制成10×PBS的儲備液，2×PBS和1×PBS可用DEPC水稀釋獲得。
除用DEPC水配制PFA外，也有用滅菌蒸餾水或經DEPC處理的0.01～0.1mol/L的PBS配制的，方法及注意事項同上。
4% PFA是目前原位雜交組織化學技術中最常用的固定液，它能較好地保持組織及細胞內的RNA，同時對形態保持也較好。通常組織塊固定4～12h，載片固定時間在10～15min以內，RNA含量較為恒定。過度延長固定時間會引起細胞內生物大分子的過度交聯，影響探針的穿透力，降低雜交效率。
2．甲醛
①10%甲醛（Formaldehyde,FA）
量取二者充分混合而可。較適于檢測RNA的組織及細胞固定，也可用于新鮮冰片切片后固定。
②10%福爾馬林試劑：
較適于固定細胞。
③10%中性福爾馬林
市售甲醛 100ml
Na2 HPO4 4g
NaH2 PO4 6.5g
DEPC水 ～1000ml
常用于石蠟樣品切片的固定。
10%的甲醛由于有促進DNA雙鏈分子交聯的作用，干擾DNA變性，故不適于DNA雜交。在組織或細胞原位雜交中，可通過使用含50%甲酰胺的雜交液使DNA變性解鏈而解決。這類固定液在DNA/RNA雜交中有較好的效果。
3．4%戊二醛效果較40%差。
4．0.1%戊二醛常用于固定組織，適于新鮮組織冰凍切片及石蠟切片的后固定，常用于檢測DNA的原位組織雜交方法。
5．乙醇/醋酸（或冰醋酸）將乙醇與醋酸按3：1的體積比充分混合即可。該液較適于固定細胞的原位雜交，尤其檢測DNA時。
乙醇/醋酸雖廣泛應用于原位雜交中，但RNA保留較差，可本底很低，即背景染色淡。
6．甲醇/醋酸（3：1）用前按體積比3：1比例充分混合即可。
7．甲醇/丙酮（1：1）適于培養細胞的原位雜交技術。
8．4%多聚甲醇-0.5%～1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸緩沖液中，用于免疫電鏡樣品固定。
四、LB培養基
（一）液體LB培養基（Luria-Bertani培養基）
配制：取一1000ml的燒杯，將事先稱取好的試劑加入杯內，加H2 O約500～800ml攪拌使其溶解完全。用5N的NaOH調pH至7.0,加入H2 O定容至1000ml。15磅高壓滅20min。
（二）瓊脂糖平板培養基
細菌培養用瓊脂（或瓊脂糖） 15g
液體培養基（如LB） ～1000ml
按濃度比例，將瓊脂加入液體培養基（如LB）中，稍加攪拌，用紗布或紙封好瓶口，15磅高壓滅菌20min。
五、小量質粒提取主要液體
1．溶液Ⅰ
2．溶液Ⅱ
3．溶液Ⅲ（3mol/L醋酸鈉）
加熱溶解后，再用冰醋酸（約40ml）調pH至4.8，補足H2 O至200ml。
六、雜交前處理
1．蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于雜交前標本處理，其作用是使組織達到一定消化，利于檢測分子的穿透，從而提高檢測方法的敏感性，但各種組織在不同條件下消化程度不一，因此，具體應用時，應根據組織種類、溫度確定反應時間及酶的濃度。過度消化可使組織形態結構遭到明顯破壞，核酸分子也會受到影響。通常是將其配成儲備液（1mg/ml），臨用前，再配成工作液（約0.025mg/ml）。配制方法：
精心稱藥，將二者充分混合后，分裝成小份，-20℃存放，用時再取出凍融，余者棄去。
（2）工作液（臨用前配）：
取儲備液（1mg/ml）按1：40稀釋，充分混合，即得約含Pro.K為25mg/ml的工作液。
（3）關于P-K緩沖液的配制：
稱取上述試劑，充分混合即可。
②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：
先將Tris于800ml ddH2 O中溶解，用HCl將pH調至8.0,ddH2 O定溶于1000ml，高壓滅菌，室溫備用即可。
③0.5mol/L的EDTA：
稱取EDTA溶于約600ml ddH2 O中，常需60℃持續攪拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0時，EDTA才開始溶解。待完全溶解后，冷卻至室溫，NaOH調pH至8.0,ddH2 O定溶至1000ml，高壓滅菌，室溫備用。
2．甘氨酸
（1）1mol/L甘氨酸：
稱取甘氨酸75g溶于ddH2 O或DEPC水中，最后補足ddH2 O定容至1000ml，高壓滅菌備用。該液為儲備液，-20℃儲存。
（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：
將二者按1：10比例稀釋，即得甘氨酸工作液。一般要求臨用前新鮮配制。
甘氨酸有終止蛋白酶K作用的作用，以防過度消化。
3．0.25%醋酸-0.25%醋酸酐
配制：按上述配方，先以少許DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及濃HCl。DEPC水定容至約1000ml(997.5ml)，臨用前，一邊搖動溶液一邊加入醋酸酐，充分混合。注意操作時避免濃HCl 濺出，最好在通風條件下進行。
生物體內有些組織，如神經組織中的蛋白質，對帶負電荷的核酸探針較易吸附。經該液乙酰化處理后，可使切片標本表現帶上負電荷，有排斥帶負電的核酸探針，減少非特異吸附，降低反應背景的作用。
4．RNA酶溶液
取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分裝成小份（1ml,10mg/ml），-20℃儲存。
臨用前，取RNA酶A儲備液，用2×SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）.
5.0.2%
取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振蕩使其充分混合。
七、雜交用液
1．SSC（Standard Saline Citrate, SSC）
通常配成10×，20×，50×的儲備液，如下：
配制：先稱取上述兩種試劑，溶于約800ml ddH2 O中，滴加10N的NaOH，將pH值調至7.0，補足ddH2 O至1000ml，加入終濃度為0.1%～0.2%的DEPC，分裝后高壓滅菌，可室溫保存。
該液主要用于配制予雜交液及雜交后的各種洗脫液，以保持一定的離子強度。此外，在用于雜交的濕盒內也常用5×的SSC以保持一定濕度。
2．Denhardt’s液
通常配成10×，50×或100×的儲備液
配制：稱取上述試劑，溶于800ml左右滅菌ddH2 O中，定容至1000ml后，過濾后于-20℃保存備用。
該液用于配制雜交液及予雜交液等。
3．雜交液及予雜交液
※：臨用前加；△予雜交液不加
配制：先以去離子甲酰胺與SSC于室溫混合，加入硫酸葡聚糖于50℃促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室溫常需數小時才能完全溶解。有時需旋渦振蕩。定容后充分混合。根據使用方便可分裝（最好用鋁箔將瓶子包好）存于4℃，可達數月。注意，雜交緩沖液在使用前切忌污染。
變性被打斷的無關DNA（常為鮭精DNA或鯡精DNA）可在予雜交及雜交前加入。此外，有許多物質如肝素、多聚腺甘酸、醋酸鈉等多種成份，可根據需要加入雜交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。
配制好的雜交液不宜反復凍融，否則易產生硫酸葡聚糖沉淀現象。使用前最好加熱至50℃，使其充分溶解后再加入探針分子。至于探針的濃度視實驗目的、探針類型及標記方法而異。通常RNA探針分子濃度為0.5～2μg/ml，DNA探針濃度為1μg/ml,此外，如使用35 S標記的探針，還需加入終濃度為100mmol/L的二硫蘇糖醇（Dithiothreitol,DTT）至雜交液及雜交后的洗脫液中。
八、雜交后漂洗溶液
無論用何種標記方法及何種信號顯示方法，在雜交后洗脫則是大同小異。在此，歸納幾種帶有共同性及常用的洗脫液。
該液常用于雜交后的初次洗脫，故離子強度（張力）較高。
該液常用于雜交后的第二次洗脫，離子強度較低，經過上述兩套洗脫液洗后，有的還可用2×SSC，10%（0.1%）SDS洗脫。
主要是洗去殘留的RNA，降低背景。用于以RNA為探針的原位雜交方法中。
4．Dig標記探針雜交后處理液
用ddH2 O溶液并定容至1000ml。
用ddH2 O溶解并定容至1000ml。
配制同上。
左旋咪唑有消除內源性磷酸酶的作用。
九、原位雜交信號顯示
目前應用原位雜交方法中，信號的顯示主要有放射自顯影，酶底物及免疫金銀等方法，在此歸納有關的主要試劑。
1．A-B顯影液
稱取上述試劑，按配方分別溶于50ml ddH2 O中，于顯影前，在室溫將兩者（A液及B液）按1：1混合，稍加搖動促進混合，即可將貼有切片標本的切片放入顯影液，于室溫避光（可暗室）反應5～15min。顯影時間和溫度相關，需自己根據情況摸索。終止反應只需將顯影液倒出，自來水沖洗即可。倒出的AB顯影液可暫時不扔，光鏡下觀察，若明顯顯影不夠，還可重新或繼續顯影。AB顯影液要求臨用前配制，在顯影時才將AB二液混合。否則，A液過久會產生黃色沉淀，增加背景。
AB液用于免疫金銀法中，使金標記顆粒信號放大，形成棕黑色沉淀。
2．DAB-H2 O顯色液
配制方法見附錄一。
該液用于標本被標記上辣根過氧化物酶（HRP）的方法。產物為棕黃色。
3．NBT-BCIP顯色液
配制方法，詳見附錄一。
該液用于有堿性磷酸酶標記物的方法中。產物為紫藍色。
4．Kodak D-19顯影液
配制：先將500ml水中加溫50℃，按上述配方順序加藥，同時充分攪拌，每加一種藥完全溶解后，再加另一種藥品，否則，所配的顯影液易產生混濁而效果差，最后補足水至1000ml充分混合，室溫或4℃避光保存。最好包上紙。
該液用于放射自顯影時的顯影。
5．Kodak F-5定影液（酸性堅膜定影液）
※：28%醋酸為3份冰醋酸和8份水混合液。
配制：同Kodak D-19顯影液。
