小麥總RNA的提取
實驗目的
從黃化小麥苗中提取總RNA ，可以為cDNA 文庫的構建做好準備。我們重點是要保證RNA 的完整性、產率、防止修飾和純度，尤其是完整性、防止修飾和純度。RNA 是單鏈，2’OH是它的化學性質遠比DNA 活潑。所以，提取RNA 頗為不易。
加之RNA 的不均一性，要將所有的RNA （rRNA 、tRNA 、mRNA ）完全提出，更加有挑戰性。
而Rnase是無處不在的（這種酶遇高溫后也不會喪失活性，復性容易，在胞內外都有分布，不需激活，不需要二價金屬離子的配合）； RNA 還最怕DNA 污染，因為若做RT-PCR ，DNA 的存在會降低產物的純度和效率所有以上的因素都構成了我們成功提取RNA 的障礙。但是我們可以不用考慮RNA 的機械剪切，因為RNA 通常較小，一般不會受到機械剪切的影響。
實驗原理及過程
實驗步驟 | 實驗原理 | |
| 1 | 所有容器高溫滅菌兩次，DEPC高溫滅菌，所有的試劑用DEPC配制，高溫滅菌。 | 去除RNA 酶（外源）的影響。 高溫滅菌兩次可以破壞RNA 酶的復性過程.雖然RNA 酶極易復性，但兩次連續的高溫會打亂它的復性歷程，從而使RNA 酶失活。 DEPC是RNA 酶的非競爭性抑制劑。DEPC可以與RNA 酶的活性中心的組氨酸咪脞環上的N結合，從而使RNA 酶失活。 因為DEPC能與RNA 的N結合，從而修飾RNA ，所以，必須將DEPC最終除去。在高溫滅菌時，DEPC因高溫分解而揮發。（UV也能修飾RNA ，實驗時應避免。） DEPC滅菌后稱為DEPC水，它是不含DEPC的。 實驗過程中要勤換手套，必要時要在超凈工作臺中進行。 |
| 2 | 在一滅菌2mL管中加入: 5mol/L異硫氰酸胍 0.7mL 苯酚 0.4mL 2mol/L NaAc(pH4.0) 0.1mL | 必須提前準備好變性劑。 異硫氰酸胍可以變性RNA 酶，也可以破細胞。本試驗不可以用酶法破細胞。因為蛋白酶K的適合的條件也可以是RNA 酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA 在有機相（酚相）中，而在堿性條件下，DNA 和RNA 都在水相中，無法分離，所以，Ph在本是嚴重很關鍵。 苯酚用于抽提DNA 和蛋白質。 |
| 3 | 稱取0.2g小麥黃化苗的葉片，迅速在液氮中研磨成粉末,轉入已準備好的離心管中。 劇烈震蕩。 | 低溫防止內源性RNA 酶降解RNA 。 劇烈震蕩是使所有的細胞散開，浸在變性劑中。低溫的細胞在相對來說高溫的液體中是會形成一團，這樣就會使內部的RNA 沒有水解RNA 的機會。 小麥的黃化苗因為沒有光合作用，所以含糖少，易于抽提。 |
| 4 | 混勻,冰浴30min。 | |
| 5 | 4℃,12000rpm,10min。 | |
| 6 | 上清至另一離心管中 加0.4Ml氯仿，劇烈震蕩。冰浴放置5min。 | 去脂類。 |
| 7 | 40C,12000rpm,10min。 | |
| 8 | 棄有機相（下層） 加入0.4Ml氯仿和0.4Ml酚。室溫放置5min。 | 去脂類和蛋白質。 |
| 9 | 40C,12000rpm,10min 棄有機相，加入等體積異丙醇。-200C放置1h。 | 去糖，脫水。因為體系高鹽（2mol/L NaAc），所以可以使RNA 沉淀。 |
| 10 | 40C,12000rpm,10min 沉淀用70%乙醇洗兩次。 | 因為提出的量很少，可能不可見，所以離心是要有方向標記。 |
| 11 | 室溫稍干燥。 | RNA 是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因為有太多的糖的殘余。 |
| 12 | 沉淀加20uLDEPC水溶解(-200C保存) | DEPC水中不含RNA 酶。 |
| 13 | RNA 電泳 ： 1%瓊脂糖膠20 mL 8μL樣品 1μL樣品緩沖液 1μLSYBR 100V恒壓電泳 測OD260 和OD260 /OD280 |
