siRNA實驗成功要點

1. 對每個基因設(shè)計并檢測兩到四個siRNA 序列

為了找到潛在靶位點，掃描靶基因中的AA序列。記錄每個AA 3’端19個核苷酸作為潛在siRNA 靶位點。潛在靶位點需通過GENBANK數(shù)據(jù)庫的BLAST分析，去除那些與其它基因明顯同源的靶位點。如果可能，siRNA 應(yīng)根據(jù)mRNA 低二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域設(shè)計。美國著名RNA 產(chǎn)品公司Ambion提供網(wǎng)上在線設(shè)計工具，幫助您更快地完成這項工作。

2. 選擇低GC含量的siRNA

Ambion公司研究發(fā)現(xiàn)GC含量在40-55%的siRNA 比55%以上的活性高。

3. 純化體外轉(zhuǎn)錄siRNA

在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA 的大小和純度。為得到高純度的siRNA ，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫（Ambion siRNA 體外合成試劑盒中已包括純化柱保證siRNA 純度）或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA 通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。

4. 避免RNA 酶污染

微量的RNA 酶將導(dǎo)致siRNA 實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA 酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品…因此保證實驗每個步驟不受RNA 酶污染非常重要。Ambion公司在這方面有一整套的產(chǎn)品線，如除RNA 酶的噴劑，拭紙及液劑，檢測和去除RNA 酶。

5. 健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性

通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。

6. 避免適用抗生素

Ambion公司推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA 轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。QIAGEN推出的專門針對RNA 轉(zhuǎn)染的試劑

7. 選擇好的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA

針對靶細(xì)胞類型，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA 實驗的成功至關(guān)重要。siRNA 實驗要求選擇適合轉(zhuǎn)小的RNA 的轉(zhuǎn)染試劑（目前大多數(shù)轉(zhuǎn)染試劑都針對轉(zhuǎn)染比較大的質(zhì)粒DNA，而非小的RNA 分子，宿主范圍大小也不同）。Ambion公司的Silencer siRNA Transfection Kit，QIAGEN的Transmessenger Transfection Reagent都是專門針對轉(zhuǎn)siRNA 優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑，是您的理想選擇。

8. 通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件

對大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA 轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞（同樣適合實驗靶siRNA ），轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA 相對于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過多的siRNA 將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。Ambion公司提供多種靶基因的陽性siRNA 。

9. 通過陰性對照siRNA 排除非特異性影響

合適的陰性對照可通過打亂活性siRNA 的核苷酸順序設(shè)計而得。必須注意它要進行同源比較確保相對所要研究的生物的基因組沒有同源性。

10. 通過標(biāo)記siRNA 來優(yōu)化實驗

熒光標(biāo)記的siRNA 能用來分析siRNA 穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA 還可用作siRNA 胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實驗（配合標(biāo)記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了siRNA 的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。