RNA抽提指南(TRIZOL法)

注意事項：

* 全程佩戴一次性手套。皮膚經常帶有細菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養良好的微生物實驗操作習慣預防微生物污染。

* 使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實驗室可能用RNA酶A 或T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可能富含RNA酶。

* 在TRIZOL 中，RNA 是隔離在RNA 酶污染之外的。而對樣品的后續操作會要求用無RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中烘烤4 小時。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。

抽提步驟：

1．勻漿化作用

通過離心來沉淀細胞后，棄上清，用移液管加TRIZOL試劑反復吹打來裂解細胞至均一通亮的液態后，將勻漿樣品在15―30°C 條件下孵育5 分鐘以使核蛋白體完全分解。

（每5―10×106的動物細胞，植物或酵母菌細胞或每1×107 細菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前應避免洗滌細胞因為那樣會增加mRNA降解的可能性。）

2．分離階段

每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15 秒并將其在30°C 下孵育2―3 分鐘。在2―8°C 下以不超過12,000×g 的離心力高速冷凍離心15 分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA 無一例外地存在于水樣層當中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL 容量的60%

3．RNA的沉淀

將水樣層轉移到一干凈的試管中，通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。最初均化時的每1 mlTRIZOL 對應0.5 ml 異丙醇。將混合的樣品在 15―30°C 條件下孵育10 分鐘并在2―8°C 下以不超過12,000×g 的離心力高速冷凍離心10 分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。

（如果希望分離DNA 和蛋白，有機層同樣要予以保留。在除去水樣層后，樣品中的DNA 和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA 對于樣品間標準化RNA 的產量十分有用。）

4．RNA的洗脫

移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA 沉淀一次，每1 ml 的TRIZOL 至少加1 ml 的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2―8°C 下以不超過7,500×g的離心力高速冷凍離心5 分鐘。

5．RNA的再溶解

在操作的最后，簡單干燥RNA沉淀。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀完全干燥那

樣會極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280 比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶液來溶解RNA，并在55―60°C下孵育10 分鐘。

TRIzol法抽提總RNA
組織100mg
↓
加1mlTRIzol
↓
勻漿（要徹底，后轉至EP管）
（組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管）
↓
顛倒混勻10下，室溫5分鐘（30°C孵育）
↓
加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）
↓
顛倒混勻15S，室溫2-5分鐘（30°C孵育）
↓
4℃，離心12000g，15分鐘
↓
轉上層水相（約400μl）于另一1.5mlEP管中
↓
加等體積異丙醇（約400 -500μl），混勻室溫10分鐘
↓
4℃，離心12000g，10分鐘（30°C孵育）
↓
棄上清
↓
加冰預冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml
↓
4℃離心7500g，5分鐘
↓
棄上清，空氣干燥5-10分鐘（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）