RNA 分析的幾個熱點領域及主要技術路線

DNA，RNA和蛋白質是三種重要的生物大分子，是生命現象的分子基礎。基因組織DNA中的基因通過轉錄為mRNA并進一步翻譯為蛋白質，很多種類型的蛋白質在最終發揮功能時又經歷磷酸化、糖基化、酶原激活等翻譯后修飾。DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀，而mRNA在信息傳遞中起很重要的作用。其它兩大類RNA，rRNA和tRNA，同樣在蛋白質的生命合成物中發揮不可替代的重要功能。因此，mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現生命性狀的蛋白質的過程中舉足輕重。目前國內外在mRNA的表達研究上如火如荼，這對于后基因組時代闡明基因的功能至關重要。
但RNA在生命活動中的重要作用遠不止如此：很多種類的病毒直接以RNA為遺傳信息攜帶者，如SARS和AIDS等；而很多其它種類的不編碼蛋白質的RNA分子在生命活動中起其它重要作用，如大分子生物加工和基因表達調控等。下面簡要列舉一些重要的RNA分子及其生物學意義：
gRNA(導引RNA):mRNA編輯
snRNA(核內小分子RNA):mRNA加工（剪接和成熟）
snoRNA(核內小分子RNA):rRNA成熟加工(切割和修飾)
RNA P(RNA聚合酶):rRNA加工
Telomerase(端粒)RNA:DNA復制，端粒合成
SRP（信號識別顆粒）－RNA：轉運，蛋白分泌
　　tmRNA：破損mRNA蛋白質合成的終止
Lin-4:發育控制反義RNA(antisence RNA for development control)
rps14:核糖體生物合成反義RNA(antisence RNA for ribosome biogenesis)
dsRNA(雙鏈RAN)：基因沉默(gene silence)
Xist(Xi-specific transcript)&其反義RNA Tsix:　X染色體失活
尚有很多RNA的功能還未鑒定，如很多scRNA（細胞質小分子RNA）、用沉降系數命名的7S，10SRN等。一些生物催化劑如核酶也是RNA。
國內中山大學和上海生命科學院等在這些非編碼RNA的研究中做了大量工作，在國際上也占有一席之地。
RNA的種類可能還遠不止這些，每種RNA的功能也遠不止上面提到的那么簡單。隨著研究的深入，更多種類的RNA和RNA的功能在被詮釋。因此生命科學中的一個新的學科RNA的組學(RNomics)正在興起。
勿容質疑的現實是：在所有種類RNA功能等的研究中，mRNA的表達研究是最主要的熱點。特定生物的基因在不同發育階段、不同生理病理條件、不同細胞類型中的表達不盡相同，了解基因表達的開放與否和表達水平高低對闡明基因的功能至關重要。MRNA表達研究的傳統技術如Northern、原位雜交和定量RT-PCR等低通量技術適于少量基因的表達研究。但我們知道：參與任何一個生命過程的基因種類都有很多，因此低通量技術已經不適合大量基因表達的研究，高通量研究基因表達的技術應運而生，在這些技術中，DD-TCR和SSH技術操作復雜，假陽性率很高；因此近二十年來發展起來的DNA微陣列技術尤其是全基因組DNA微陣列技術成為獲得基因表達信息的最好技術平臺，該技術可以在盡可能短的時間內篩選出參與一個生命過程的所有的基因的表達數據。
DNA微陣列技術主要有兩種：cDNA微陣列和寡核苷酸微陣列。在cDNA微陣列中，每個基因的探針為cDNA或基因的一段PCR產物；這種探針設計策略很難特異區分諸如RNA剪接體、重疊基因和G蛋白偶聯受體等同源基因。寡核苷酸微陣列技術又包括兩種：約70mer的寡核苷酸微陣列和Affymetrix 25mer寡核苷酸基因芯片(Genechip)。在70mer微陣列中，每個基因的探針為該基因的一段70mer的特異寡核苷酸片段。在Affymetrix基因芯片中，每個基因都有10-20個特異探針(PM探針)，每個探針為 25mer的寡核苷酸片段；每個探針還有對應的錯配(MM探針)。探針特異性由大到小的排序為：25mer>70mer>cDNA。因此，Affymetrix基因芯片技術可以保證基因表達檢測的最好特異性。由于MM探針可以有效扣除總雜交信號中的背景信號，得到真正的雜交信號，因此Affymetrix基因芯片技術還可以保證基因芯片檢測的高靈敏度，這里的高靈敏度指可以檢測到低豐度表達的基因，也同時指低豐度表達的基因的表達水平發生變化時可以被檢測出來。目前看來，Affymetrix基因芯片技術可以保證基因表達檢測的最好特異性、最高靈敏度、最好的重復性可靠性及最好的定量分析。因此Affymetrix基因芯片技術得到的基因表達信息基本沒有必要通過定量RT-PCR、原位雜交和 Northern等技術來驗證。
當然，Affymetrix基因芯片技術的局限性在于該技術依賴基因組序列信息。如果一個物種的基因組序列信息已知，Affymetrix就可以通過生物信息學等設計代表每一個基因的特異的探針。盡管Affymetrix芯片涉及的物種已經居全球首位(Affymetrix公司目前能提供的芯片物種信息見本刊后面的專題介紹)，由于很多生物沒有基因組序列信息，高通量研究這些生物的基因表達信息還只能依賴構建cDNA文庫并制作cDNA微陣列，這樣得到的基因表達信息需要通過定量RT-PCR、原位雜交和Northern等技術來驗證。
基因芯片得到的基因表達數據很豐富，通過生物信息學可以得到其中最具有價值的信息，比如哪些基因可能與研究者研究的生理或病理現象直接相關。對于這些重要基因的功能的研究，下一步的技術包括RNAi，基因敲除和轉基因技術等。而基因功能的最終闡明需要結合蛋白質(組)的研究等。
最后需要指出的是，不同細胞類型在不同生理或病理條件下或在不同的發育階段，其基因表達情況不盡相同，如果采取勻漿技術獲得含多種類型細胞的組織中的mRNA并雜交基因芯片，那么得到的數據無法精確解釋每一類細胞的基因表達情況。建立細胞類型特異性的基因表達數據對研究生命現象的分子機理很重要，可以通過激光顯微切割(laser microdissection,LMD)技術將一個組織中不同類型的細胞進行分離，從不同細胞類型中分別得到各自的Mrna，然后分別雜交基因芯片。那當然，LMD技術對建立細胞特異性的蛋白質表達數據信息也至關重要。

RNA干擾研究前沿和應用領域

小RNA(MicroRNA,miRNA)作用與應用研究繼2001，2002連續兩年被美國《Science》雜志評為年度10大突破技術以來，2003年繼續熱度高漲，名列前矛。其核心技術RNA干擾(RNAi ),即用20多個核苷酸組成的短的雙鏈RNA(siRNA)代替傳統反義核酸進行轉錄后基因沉默，已經迅速而廣泛地應用到基因功能，基因表達調控機制研究等熱門領域，不僅如此，它還為基因治療開辟了新的途徑。近兩年來，這方面的科學論文及報道爆炸性增長，幾乎每天都有新的結果涌現。此外，RNAi沉默機制的探索方面也取得了相當的進展。在大致勾畫出生物體內源性小RNA的重要作用框架后，2003年生物學家致力于闡述進一步的細節，探索小RNA如何調控細胞的行為，如何RNAi進行疾病防治等等。以下就分幾個方面為大家介紹一些近幾年RNA干擾的主要研究領域及前沿進展。
一． 外源RNA誘導RNAi的應用
1. 基因功能研究
從2001年《nature》雜志上首家報道在哺乳動物培養細胞中通siRNA成
功誘導了特異性靶基因表達沉默后，RNA干擾技術就作為一項特異性基因沉默的有效工具從低等生物成功進軍哺乳動物領域。2003年Rubinson DA等又在 Nature Genetics上報道用病毒系統在原代哺乳動物細胞，干細胞和轉基因小鼠都取得了RNA干擾成功，更大大擴展了這項技術的應用范圍。研究者們可以利用這項技術對目標基因進行特異性的表達沉默，通過觀察目標基因表達被抑制后細胞以至生物體從形態到各項生理生化的變化，對該基因的功能及參與的信號網絡進行研究。這比起傳統的基因敲除方法要簡單而且方便很多，因此短短幾年，就有了很多突破性的成果。其中研究得最多的是跟疾病相關的一些基因，不僅對疾病機制及相關代謝網絡有了進一步認識，也為基因治療及藥物篩選提供了一些借鑒。
在具體誘導方式方面，目前報道的成功的siRNA形式多樣，其中短發夾結構RNA(shRNA,short hairpin RNA)表達載體的應用大大加快了研究者從最初的培養細胞水平擴展到成體水平的步伐。例如，在神經生物學研究中，開著車NIH的Backman C等通過siRNA表達質粒對中腦腹側神經細胞中的多巴胺能相關基因進行了有效抑制，Hommel JD等還通過病毒介導的RNAi建立了此類成年小鼠模型，不僅為建立神經系統的功能缺失模型找到了一些有價值的表型標記，對神經系統的基因治療也有一定借鑒意義；在癌癥研究中，Zhang Y等也通過shRNA表達載體成功抑制成年大鼠腦癌基因，并對RNAi的遠程（穿過血腦屏障）基因沉默方法進行了非常有益的探索凋亡途徑，Zender L等通過RNAi抑制凋亡基因Caspase-8能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率，并發現Caspase 8 siRNA處理對特異性Fas激活劑(Jo2和ADFasL)和野生型腺病毒介導的急性肝功能衰竭都有效，顯示了這個動物模型能反應人類急性病毒肝炎的多分子參與的機制，增強了siRNA用于急性肝炎病人治療的希望……
除了對某些關鍵基因的RNAi研究外，Zheng L等還在哺乳動物細胞中探索了siRNA在基因組水平上的篩選方法。他們建立了一個包含8000多個基因的siRNA表達框文庫陣列，通過它來高通量篩選NF-kB信號途徑中已知的及Unique基因。由此可見，RNA干擾正作為篩選成百甚至上千基因的工具，發揮著越來　越大的作用。
總的來說，RNA干擾為系統地RNA抑制分隊合成蛋白提供了快速而相對簡便的途徑。通過在一段時間內對一個基因RNA信號的抑制，研究者可以深入研究基因功能，進而開始支配從細胞形態到信號系統的遺傳網絡。
2. 基因治療及藥物篩選探索
由于RNA干擾是針對轉錄后階段的基因沉默，相對于傳統的基因治療對基因水平上的敲除，整修流程設計更簡便，且作用迅速，效果明顯，為基因治療開辟了新的途徑。其總體思路是通過加強關鍵基因的RNAi機制，控制疾病中出現異常的蛋白合成進程或外源致病核酸的復制及表達。尤其針對引起一些對人類健康嚴重危害的核酸病毒，如去年全球多個國家和地區滸的SARS這種主體是單鏈核酸的新型冠狀病毒，尋找藥物靶點，設計核酸藥物就更加方便。目前已經有很多公司在積極開發這方面的藥物，如在去年SARS藥物研究中一鳴驚人的美國俄勒岡州的AVIBioPharma生物制藥公司等國。國內也有很多研究機構及生物技術投入了這方面的工作。如上海生科院成立了SARS防治科研攻關領導小組，其中生化細胞所和藥物所的一些課題組在從RNA干擾的角度努力。此外，北大，中南大學，動物所等大專院校研究機構以及北京金賽獅反義核酸技術開發有限公司也開展了RNA干擾藥物的研究與開發。
基因治療方面去年最引人注目的進展之一是對肝炎的RNA干擾研究。McCaffrey　AP等通過表達shRNA的載體在培養細胞水平和轉染HBV質粒后免疫活性缺失的小鼠肝臟中成功抑制了HBV復制。與對照相比，小鼠血清中測得的HbsAg下降84.5%，免疫組化對HbcAg的分析結果下降率更超過99%。另，哈佛大學Liberman的研究小組通過注射針對Fas的siRNA，過度激活炎癥反應，誘導小鼠肝細胞自身混亂。然后給測試小鼠注入使Fas hyperdrive的抗體，發現未進行siRNA處理的對照組小鼠在幾天中死于急性肝功能衰竭，而82%的siRNA處理小鼠都存活下來，沒有患病，它們當中80-90%的肝細胞經證實結合了siRNA。并且，RNAi發揮功能達10天，三周后才完全衰退。由于Fas很少在肝細胞外的其它細胞高表達水平，對它的抑制對其它器官幾乎沒有副作用。此外，這個小組還和其它研究者積極開展針對HIV的RNAi測試，目前報道他們使用的針對CCR5蛋白的siRNA能阻止HIV進入免疫細胞約三周，在已經感染的細胞中也能阻止感染的病毒復制。
然而，盡管取得了不少成果，要真正用于醫療還需時日。目前大多數還停留在小鼠測試階段，siRNA的導入采用靜脈或腹腔注射，尾部注射，細胞移植等，如何對人進行有效的給藥，既要確保藥效在靶器官靶組織有效釋放，還要具有高度安全性等等尚需進一步研究。我們期待著RNAi引領的新醫學革命的到來。
在藥物篩選領域，除了線蟲這咱低等動物的RNAi高通量藥篩模式外，2003年Lavery KS等的綜述中也對RNAi在藥篩領域的應用前景進行了高度評價：RNAi技術將交逐漸成為藥物靶點篩選和鑒定的強大工具。他對如何在藥篩的各個階段應用RNAi做了具體描述及展望，并指出將這項技術與高通量篩選，體外生物檢測和體內疾病模式相結合，將提供大量基因功能方面的有用信息，在藥物開發過程的多個階段促進靶點的篩選。
二．內源RNAi機制及功能研究
是什么原因使我們有可能通過外源siRNA誘導內源性的靶基因轉錄后沉默？為解開這個迷是題，更有效地進行RNAi應用，隨著RNAi應用研究的廣泛開展，生物體內部RNAi機制研究也愈加深入，并迅速成為RNAi研究中的重要領域，吸引越來越多的研究者投身其中，涌現出一系列令人耳目一新的新的成果。
多年來，生物學家認為RNA在生命過程中的作用僅僅是從DNA傳遞遺傳信息到蛋白，就象蜂群中的雄蜂般沒有創意。但近幾年的一系列發現使研究者對RNA，尤其是mRNA以外的哪些小RNA的功能有了全新的認識。生物體中有一群小RNA（目前看來人體中編碼約255種小RNA，竟占整個基因組近1%，很多可能編碼自以前被認為“垃圾RNA”的區域），它們也可通過自身的RNAi機制，在生命過程的各個階段關閉或調控基因表達水平，從而控制細胞的多種生命活動。尤其在過程中2003年有一些激動人心的最新發現：僅約22個核苷酸長度的小 RNA，發現竟能引導早期發育――從使植物葉片成形到介導果蠅胚胎在植物組織中的細胞增殖：缺少RNAi蛋白Dicer（一種RNA酶III家族的酶，參與RNAi過程中對RNA的剪切）的小鼠會缺少干細胞某些分化(swaths of stem cells)在出生前就夭折；小鼠中特定的小RNA能幫助引導干細胞生成胚胎的血細胞系統。
此外，有些RNAi現象能在DNA編碼不變的情況下傳代，甚至在一些物種中對基因組織進行調整，有人形象地比喻它為“引導基因組的手”，生動體現了小RNA源于基因組但對基因組所具有的強大反饋作用?！禨cience》上一篇題為：RNAi Extends Its Reach的綜述詳細闡述了RNAi途徑已經不僅僅限于沉默mRNA，還作用于基因組。這方面的具體機制還不是非常明確，但在植物中發現伴隨有DNA甲基化現象，科學家們預測要描繪一張完整的RNA引導基因組改變的圖譜可能需要對RNA信號，DNA甲基化和組蛋白修飾之間的相互作用進行更進一步的研究。
綜合來看，我們可將目前報道的內部RNAi機制可能的功能，大致分為以下幾類：
1. 搞病毒功能
Voinnet和Li等分別在植物和果蠅中發現了通過RNAi實現的抗外源核酸機制：被大多數RNA病毒啟動的RNAi可導致病毒基因組降解。例如在果蠅細胞中，Flock house virus(FHV)就能引發果蠅內部的RNAi反應，產生FHV特異性的siRNA來降解感染的FHV。
2. 基因調控
目前在人、蠕蟲，果蠅和植物等生物體中都發現了小RNA，有的通過結合3’
非翻譯區（UTR）和靶mRNA抑制mRNA翻譯，有的siRNAi機制破壞靶基因轉錄本。對基因表達水平進行調控。
3. 染色質濃縮
內源的siRNA，一些小RNA可能通過使染色質濃縮調節基因表達。一些研
究小組發現dsRNA結合到植物啟動子區域能通過一種使DNA甲基化的作用導致基因沉默。此外，在蠕蟲體內檢測到許多Polycomb蛋白（能結合染色質）是RNAi過程所必須的：裂殖酵母中內源siRNA可介導中心泣區染色質濃縮，導致這個位點的基因轉錄沉默。如Vera Schramke等在裂殖酵母中通過合成shRNA反式抑制同源位點，導致在mate區沉默的Swi6染色質濃縮。這些結果都提示一些內源性的siRNA通過導致染色質濃縮來調節基因水平。
4. 轉座子沉默
目前，兩方面的證據提示轉座子沉默涉及siRNA。其一，發現蠕蟲mut-7基
因參與RNAi和轉位抑制。其二，從裂殖酵母的忠心粒區分離出siRNA，并檢測到這些siRNA介導此區內組蛋白甲基化。由于中心粒區包含重復序列――含轉座子片段，一些減數分裂基因中也發現了通過其附近的逆轉錄轉座子LTR（長末端重復序列）介導的RNAi，推測在siRNA介導的中心粒區域的組蛋白甲基化可能源于古老的轉座子沉默作用。
5.　基因組重組
siRNA可能參與纖毛蟲，四膜蟲結合中的基因重組。結合到重組序列的
siRNA，在蟲體之間的結合過程中介導DNA缺失和染色體斷裂。有趣的是，在這些siRNA介導的程序性DNA刪除事件中，也發現需要重組區域組蛋白的甲基化。
結語：RNAi的確有太多的值得研究的領域和值得期待的發現，我們真誠地
希望科學界能在探索小RNA世界的潮流中占據令人矚目的一席。