鼠腦RNA提取、RT－PCR及GST融合蛋白純化
一．鼠腦RNA提取
（1）RNA提取常用3種方法：A.異硫氰酸胍、氯化銫密度梯度分離植物RNA
B.SDS－酚－氯仿法
C.硫氰酸胍－酚－氯仿法在制備用于反轉錄PCR的RNA時最實用
（2）總RNA的提取方法是基于RNA與其他胞內大分子在溶解性和沉降性上的差異得以實現的，提取基本步驟：
1.破碎細胞
2.RNase失活
3.RNA去蛋白
4.RNA與其他大分子的物理分離：酚、離子變性劑和胍鹽組合抽提(酚、氯仿抽提步驟，將RNA從DNA中分離出來，在操作過程中的酸性條件下，DNA溶解性降低，大部分留在有機相，RNA則進入水相)
5.將RNA抽提到水相后，用鹽將之在乙醇或異戊醇中沉淀下來。
（3）RNA極易降解，要得到完整的RNA必須最大限度地抑制提取過程中內源性及外源性RNA酶對RNA的降解。
1．外源RNase污染可通過預先采取措施避免。
①實驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經常有RNA酶污染，用0.1%DEPC的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，小指管、PCR管和其他用品。浸泡12h后，121℃高壓滅菌30min（2次），70℃—80℃烘干。
②取鼠腦的剪刀、研缽、鑷子等干熱滅菌：160℃，2小時。
2．內源RNase在一些組織中，如胰腺中相當豐富，內源RNase活性可通過使用足量的胍鹽、酚、SDS或其他的強變性劑得以大大降低。
3．如果發生了不可解釋的降解，就應該考慮加入RNase抑制劑。
（4）TaKaRa RNA提取試劑盒提取RNA（稍做改動）
Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。Trizol適用于從多種組織和細胞中快速分離總RNA。
1．用液氮速凍，將組織磨成粉末，趁液氮尚未揮發光時，把粉末轉移到eppendorf 管中，每50—100mg組織加1.0ml的 Trizol。（勻漿的樣品可在-60—-70℃保存至少一個月）
2． 勻漿后的樣品15—30℃溫育5分鐘（使核蛋白復合體徹底解離），加入200μ l氯仿，用手劇烈振蕩混勻15秒，冰浴2—3分鐘。
3． 用臺式離心機，不超過11400轉/分，2—8℃離心15分鐘。混合物分3層：下層紅色酚氯仿相，中間層和上層無色水相。RNA在水相中，水相體積約為Trizol體積的60％，即0.6ml。
4． 將水相小心轉移到RNase-free 1.5ml離心管里，加入0.5ml的異丙醇(沉淀RNA)，-20℃靜置20分鐘。（不要吸取任何中間層物質，否則會出現Genomic DNA污染。）
5． 用臺式離心機，不超過11400轉/分，2—8℃離心10分鐘。此時在管底和管壁可見沉淀的RNA，為凝膠狀小球。
6． 小心移去上清液，防止沉淀丟失。
7． 用75%酒精洗滌1次，至少1ml，渦旋振蕩混勻，不超過8900轉/分，2—8℃離心5分鐘。
8． 盡可能徹底地吸走上清，防止丟失RNA沉淀。
9． 空氣干燥或真空干燥5-10分鐘（不可真空離心干燥）。
10．50μl DEPC-H2O溶解。用槍吹打幾次使RNA溶解，存于-20℃。
二．RT－PCR
（1）逆轉錄(20μl)，依次加入：
1．MgCl2（25mM） 4μl
2．無Rnase H2O 1.5μl
3．10×RNA PCR buffer 2μl
4．40單位/μl胎盤抑制劑 0.5μl
5．dNTP 混合液(各10mM) 2μl
6．特異性引物（終濃度2pM） 4μl
7．樣品RNA 5μl
8．AMV反轉錄酶 1μl
溫育在42℃反應60min
反應管99℃加熱5min，使反轉錄酶失活和RNA-cDNA雜合物變性。
（2）PCR(50μl體系)：（逆轉錄20μl體系每管分裝2管10μl＋以下40μl組成50μl PCR體系)
1．無Rnase水 23.5μl
2．10×RNA PCR buffer 4μl
3．MgCl2（25mM） 3μl
4．上游引物（終濃度0.8pM） 4μl
5．下游引物 4μl
6．TaKaRa Taq 1.5μl
94℃ 預變性3 min
40個循環 94℃30s 兩個溫度50℃/55℃30s 72℃45s
72℃10min 取擴增樣20μl，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳來分析擴增結果。不用甲醛變性膠，普通瓊脂糖凝膠即可。
用特異性5’和3’引物PCR失敗，改用oligodT代替特異性3’引物后得到的片斷小于目的片斷，分析認為是RNA二級結構嚴重，嘗試65℃保溫消除二級結構的方法進行RT-PCR，即將特異性引物和總RNA混合后先65℃保溫10分鐘，再加入dNTP等其他成分，結果表明該法可行。
三．GST融合蛋白純化
（1）GST親和純化
1．介質保存：20％乙醇
2．所需試劑：
①10×PBS（1L）： pH7.4 (4℃)
150mM NaCl（87.75g），16mMNa2HPO4(57.3g)，4mM NaH2PO4(6.24g)
②10×洗脫前buffer（100ml）： pH8.0 (25℃)
50mM Tris（6.1g），100mM NaCl(5.8g)
③洗脫buffer即凝血酶酶切buffer(500ml)： pH10.0 (25℃)加入谷胱甘肽后pH變為8.0
50mM Tris（3.035g），100mM NaCl(2.925g)
洗脫前加1M CaCl2至終濃度2.5mM，加還原型谷胱甘肽（干粉）至終濃度20mM
也有文獻使用谷胱甘肽終濃度為10mM，未對比過。
8ml介質結合的融合蛋白一般用30ml洗脫buffer（加75μl CaCl2和0.12g還原型谷胱甘肽）
④3M NaCl
3．純化步驟及注意事項：
①PBS平衡柱子：至少5個柱體積
②上樣：經對比發現，上樣流速需極慢才能結合，一般上樣過夜（純化原理是谷胱甘肽巰基轉移酶融合蛋白對谷胱甘肽的親和力）
③PBS洗雜蛋白：洗到紫外監測基線平，至少1小時，時間充分的話最好用較慢流速洗2到3小時，這樣洗脫下來的目的蛋白中雜蛋白較少。
④洗脫前buffer換體系：至少2個柱體積，8ml介質一般用20ml
⑤洗脫buffer洗脫蛋白：洗脫速度很快，一般第2、3管濃度最大，注意收峰
⑥3M NaCl再生柱子：一般會洗出一個小鹽峰，再生時間不可過長，否則對柱子有傷害，5個柱體積即可
（2）凝血酶酶切融合蛋白（以NGB為例）
先后使用過sigma和鼎國的凝血酶，sigma的酶效率更高。
鼎國凝血酶買來為干粉，3000U每管，溶于1ml凝血酶酶切buffer（補1M CaCl2至終濃度2.5mM），分裝至每管10μl共100管，30U/管。
合并GST柱下來的目的蛋白，紫外分光光度計OD595測蛋白濃度。用鼎國凝血酶摸酶濃度：每35mg蛋白用凝血酶50μl，酶切約20小時。
對比25℃水浴酶切和搖床中酶切，定時取樣檢測酶切結果，發現搖床中酶切更快（可能是搖動過程中酶與蛋白能充分結合），但搖床中酶切產生的沉淀也更多。
四．我負責配制的幾種試劑
（1）蛋白marker：
鼎國marker：直接分裝，5μl/管
華美marker：每瓶干粉加300μl水和100μl 4×loading buffer，充分溶解混勻后分裝于40管500μl小指管，10μl/管，沸水中煮3－5分鐘。（小指管一定要蓋嚴，否則煮時進水）
（2）IPTG：（500mM）分子量238.31
在超凈臺中操作， 一般一次配5g，將干粉溶于42ml milliQ水，經一次性濾器濾過后，
分裝至滅菌小指管中。（IPTG一定要充分溶解）
（3）氨芐：（50mg/ml）
在超凈臺中操作， 一般一次配5g，將干粉溶于100ml milliQ水，經一次性濾器濾過后，
分裝至滅菌小指管中。
