構建全長cDNA文庫：噬菌體文庫和質粒文庫注意事項
構建全長cDNA文庫分為噬菌體文庫和質粒文庫，二者大同小異。無論怎樣，應當注意如下幾個方面：
一、保證獲得數量足夠的高質量的起始RNA。
構建cDNA文庫要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允許的情況下一般的 試劑 盒均推薦采用純化總mRNA后進行反轉錄，這比直接采用總RNA進行反轉錄而構建的cDNA文庫好，雖然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中級柱子要求純化后的總mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，這就要求起始總RNA量較多。
雖然有的 試劑 盒聲稱少至幾十個納克的總RNA也可以構建cDNA文庫，但這是針對材料極為稀缺者而言，但起始RNA太少還是會或多或少影響文庫構建成功的風險和文庫的代表性。至于RNA的質量，如果采用純化總mRNA后反轉錄，則對總RNA的雜質方面要求稍松，但對RNA的完整性則一絲不茍，要求未降解。如果直接采用總RNA進行反轉錄，則對總RNA的質量要求非常高，不僅要求RNA相當完整而無降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、鹽、異硫氰酸胍等雜質少，最好是試劑盒抽提的。
二、反轉錄成功與否及反轉錄效率是關鍵中的關鍵。
這是構建cDNA文庫中最貴的一步，也是核酸質變的一步，它將易降解的RNA變成了不易降解的cDNA。反轉錄不成功，說明一次文庫方案的夭折。反轉錄效率不高表現在一是部分mRNA被反轉錄了，但還有相當一部分本該反轉錄的mRNA未被反轉；二是只有少部分mRNA被反轉錄通了即達到帽子結構最近處，而很大一部分mRNA沒有反轉錄完全，總的全長cDNA太少，這就難以構建好的全長cDNA文庫。
少量程度的mRNA降解或反轉錄不完全在SMART 4等試劑盒及手工方法構建中對文庫的滴度影響不大，但對文庫的全長性則有很大影響。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接頭連接后再反轉錄的新技術（可參考其GeneRacer說明書）從原理上是保證最終獲得全長cDNA的最好方法，但對mRNA的完整性要求非常高，理論上講必須是帶有帽子結構和Poly A結構的全長mRNA且反轉錄完全，才能進入文庫中。反轉錄完成后點樣檢測cDNA的濃度及分子量分布是很重要的。
三、反轉錄后至包裝到噬菌體外殼蛋白之前的諸多步驟的操作相對容易，但其中的層析柱cDNA分級很關鍵。這一步稍不注意會影響成功性或影響獲得的cDNA的片段分布特點。這一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通過反復懸浮和試滴保證柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。獲得的每一級的cDNA量很少，檢測時帶型很暗，所以要用新鮮做的透明薄膠檢測，根據檢測結果一定要舍棄太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因為短片段太多會嚴重影響后面的連接轉化效果及文庫質量）。
四、噬菌體文庫或質粒文庫均對載體與cDNA的連接效率要求很高，也對連接產物轉染或轉化大腸桿菌的效率要求很高。連接效率高低直接關系到文庫構建是否成功，更要注意的是文庫連接與一般的片段克隆的連接不一樣。一般的片段克隆連接是固定長度的載體與固定長度的目的DNA連接，而文庫連接是固定長度的載體與非固定長度的目的DNA連接，目的基因cDNA長的有10kb以上，短的只有500bp或更短。
一系列長度不等的cDNA與載體在一起連接的結果，不同長度cDNA的連接效率就不一樣。有的專家的經驗是，根據分級結果，有意識地將長度不同的cDNA群分別與載體連接，再分別轉化或轉染大腸桿菌，分別完成滴度檢測，最后將不同長度級別的文庫混合在一起供雜交篩選。
