MicroRNA熒光定量PCR
Micro RNA簡(jiǎn)介
微小RNA(microRNA,簡(jiǎn)稱miRNA)是生物體內(nèi)源長(zhǎng)度約為20-23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA,通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控,導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制。
是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成,不同于siRNA(雙鏈)但是和siRNA密切相關(guān)。
第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA是在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7,隨后多個(gè)研究小組在包括 人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百miRNA。到目前為止,已報(bào)道有幾千種miRNA存在于動(dòng)物、植物、真菌等多細(xì)胞真核生物中,進(jìn)化上高度保守。
Micro RNA產(chǎn)生機(jī)理
miRNA 是轉(zhuǎn)錄后長(zhǎng)片段的 RNA 分子(pri-miRNA )的一部分,首先在細(xì)胞核內(nèi)被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha處理成70-100 個(gè)核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA (pre-miRNA )。
這一發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA 運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì),被另一個(gè)雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切,得到 19-23 個(gè)核苷酸組成的成熟的 miRNA ,結(jié)合在與 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC )類似或者相同的復(fù)合物中,這個(gè)復(fù)合物參與了 RNA 干擾。
由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對(duì)引導(dǎo) RISC降解目的片段或是阻礙其翻譯過(guò)程miRNA 和它的目的 mRNA 互補(bǔ)的堿基配對(duì)決定了這個(gè)過(guò)程的特異性。通過(guò)抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由 miRNA 和它的目的mRNA 之間的錯(cuò)配程度決定的,匹配程度高的目的mRNA 將被降解。
由于miRNA 可以對(duì)不完全互補(bǔ)的 mRNA 配對(duì)來(lái)抑制蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程,因而每個(gè)miRNA 可以有多個(gè)靶基因,而幾個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過(guò)一個(gè)miRNA 來(lái)經(jīng)濟(jì)地調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá),也可以通過(guò)幾個(gè)miRNA 的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。
對(duì)于基于miRNA 調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入,將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。如下圖所示
Micro RNA的特征
已經(jīng)被鑒定的miRNA據(jù)推測(cè)大都是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、約70個(gè)堿基大小形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成的,有5’端磷酸基和3’羥基,大小約21—25nt的小分子RNA片斷,定位于RNA前體的3’端或者5’端。
最近3個(gè)研究小組分別從線蟲(chóng)、果蠅和Hela細(xì)胞中鑒定的100個(gè)新miRNA中,有15%跨越線蟲(chóng)、果蠅和哺乳動(dòng)物基因組具有高度的保守性(只有有1—2 個(gè)堿基的區(qū)別)。
Lau 和Bartel 實(shí)驗(yàn)室的同事更加認(rèn)為:所有的miRNA可能在其他物種中具有直向同源物(Ortholog,指那些起源于同一祖先,在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個(gè)門(mén)類,這些類似的基因被稱為“直向同源物”)。
Bantam 最早被認(rèn)為是果蠅中參與細(xì)胞增殖的一個(gè)基因位點(diǎn)。已知幾個(gè)包含增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)座子插入跨越這個(gè)位點(diǎn)的一段12.3kb區(qū)域會(huì)導(dǎo)致果蠅的眼和翅重復(fù)生長(zhǎng),而由轉(zhuǎn) 座子介導(dǎo)的一段跨越該位點(diǎn)的23kb片斷缺失則導(dǎo)致突變果蠅個(gè)體小于野生型果蠅。
Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導(dǎo)入21kb片斷缺失的果蠅中 使其恢復(fù)原來(lái)的大小。但是奇怪的是表達(dá)這個(gè)3.85kb片斷中的EST卻沒(méi)有同樣的效果。
Cohen將這個(gè)片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)一段90bp的高度保守區(qū),經(jīng)過(guò)RNA folding program (mfold)發(fā)現(xiàn)這個(gè)保守序列可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),使得這個(gè)區(qū)段很象是一個(gè)miRNA的前體。
這個(gè)結(jié)果經(jīng)過(guò)Northern blot證實(shí)突變果蠅的幼體缺少一個(gè)21bp的bantam miRNA ,用這個(gè)90bp的mRNA前體經(jīng)過(guò)一系列的“功能缺失”—“功能恢復(fù)”實(shí)驗(yàn),證實(shí) bantam miRNA在細(xì)胞增殖中的作用。
研究人員用計(jì)算機(jī)程序檢索在hid mRNA的3’非編碼區(qū)找到了bantam的3個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)( hid是果蠅中一個(gè)誘導(dǎo)凋亡的基因),并證實(shí) bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉(zhuǎn)錄。
miRNA 的表達(dá)方式各不相同。部分線蟲(chóng)和果蠅的miRNA在各個(gè)發(fā)育階段的全部細(xì)胞中都有表達(dá),而其他的miRNA則依據(jù)某種更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奈幌嗪蜁r(shí)相的表達(dá)模式(a more restricted spatial and temporal expression pattern)——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異。