用RNase III制備siRNA庫來誘發RNAi
小分子干擾RNA (Small interfering RNA ，siRNA ) 是一種非常有效的工具，能夠在包括哺乳動物細胞在內的多個體系中抑制特定基因的表達，從而研究某個基因的功能或者是相關信息。但是這種強有力的方法的難題之一是需要設計，合成siRNA s 和驗證其效果，從而找到最有效的siRNA s 。
這個過程需要花費相當的時間和經費。以化學法合成基因特異的siRNA s 為例，由于設計好的siRNA s 中通常只有大約25% 的siRNA s 能高效抑制基因的表達（抑制效率>80% ），這使得化學合成siRNA 的成本升高。
體外轉錄制備長片斷RNA 并不難，但是由于研究表明長片斷的雙鏈RNA （>29bps ）在哺乳動物細胞中通常會引發抗病毒反應―― 一種非特異基因表達抑制，而目前體外轉錄往往無法制備小于29bp 的小分子siRNA s 。
一個新的研究發現，用RNase III 降解長片斷雙鏈RNA 成為siRNA s 庫也能夠有效誘導特異的基因沉默，這樣可以避免了篩選有效siRNA s 的漫長過程，從而快速，經濟的實現特定基因表達的沉默。
在線蟲、果蠅和其他一些物種的RNA 干擾(RNA interference ，RNA i) 通路中，長片斷的雙鏈RNA 進入細胞后會被一個類似RNase III 的內切核糖核酸酶(Dicer) 降解為一系列的21―23bp 長度，3’端有兩個堿基突出（帶羥基）5’磷酸化的siRNA s 。這些siRNA s 介導同源轉錄本的降解，從而導致基因表達沉默。( 1-5)
大腸桿菌Escherichia coli RNase III 參與多種細菌RNA s，噬菌體甚至是質粒來源的RNA s 降解(6-9) ，能夠將長片斷的雙鏈RNA s降解為一系列12―15bp 的短雙鏈RNA s，產物末端結構類似Dicer 降解產物(9) ，通過改變RNA seIII 的酶切條件可以提高降解產物的平均長度，達到目前的21bp。
這些21bp的降解產物能夠有效介導在哺乳動物細胞和小鼠胚胎中特定基因的RNA i(10,11) 。另外，實驗表明，RNase III 的完全降解產物（12―15bp）同樣可以誘導專一的基因沉默，效果與化學合成或者是酶法得到的siRNA s 相當。
驗證RNaseIII 的消化能力
采用RNaseIII 分別消化體外轉錄制備的人源GAPDH ，La 和c-FOS(200 bp) 雙鏈RNA ，從而驗證RNaseIII 的消化能力，結果表明，1個單位的RnaseIII 在37度1小時可以將1mg 的雙鏈RNA 降解為30bp以下，主要是12―15bp 的siRNA s 混合物。
用其他基因的雙鏈RNA ，同樣證實RNaseIII 能夠消化各種雙鏈RNA 序列。另外用Cyclophillin, c-myc, Map Kinase 9, PKC-alpha, Raf-1, Nautilus, 和 h-ras 等基因的雙鏈RNA 作為 RNase III 底物，也可以得到同樣的結果。這表明 RNase III 能夠消化各種來源的雙鏈RNA 。
驗證 RNaseIII 降解產物誘導基因沉默的能力
GAPDH 和La 在Hela細胞中的豐度高，也比較容易檢測內源基因的表達水平。將RNaseIII降解GAPDH 和La 得到的siRNA s 庫轉入Hela 細胞，用免疫熒光法檢測其誘導基因沉默的能力。根據所檢測的細胞數量對熒光信號進行平衡化和定量。
但是內源的c-FOS 在293細胞中的豐度較低，表達水平下調后就難以檢測，為了做同樣的驗證，實驗采用50nM 佛波脂 phorbol ester (PMA) 提前24小時誘導處理使c-FOS 表達水平升高。
用由RNase III 消化c-FOS 雙鏈RNA 得到的siRNA s 混合物轉染293細胞，用同樣方法檢測對基因表達的抑制效果。結果顯示用RNase III 消化各種雙鏈RNA 得到的siRNA 庫對相應的基因表達抑制效果分別是：GAPDH 表達水平下調78% ，La 表達水平下調86% ，而c-FOS 表達水平則下調75% 。
這個結果表明RNase III 得到的siRNA s 庫能夠非常有效的抑制基因的表達。
Figure 1. Silencing Gene Targets by RNase III Derived siRNA Cocktails. A 200 bp dsRNA (15 μg) for each gene of interest was digested with 2.5 U RNase III for 1 hour at 37℃. 1A. RNase III efficiently digests dsRNA . One microgram of the dsRNA before and after RNase III digestion was run on a 15% non-denaturing acrylamide gel along with a 21 bp chemically synthesized siRNA to GAPDH, which served as a size marker. The gel was stained with ethidium bromide and photographed under UV light. 1B. RNase III derived siRNA cocktails silence GAPDH, La and c-FOS. GAPDH and La siRNA cocktails were transfected into HeLa cells. The c-fos siRNA mixture was transfected into 293 cells followed by 24 hours of stimulation with 50 nM PMA. All samples were harvested at 48 hours post transfection and immunofluorescence was performed with the appropriate antibodies. Fluorescence signal was quantitated, normalized for cell number and graphed.
