mRNA差異顯示技術(shù)[mRNA differetial display]

1.概 述
mRNA差異顯示技術(shù)（mRNA differetial display）是一種快速有效的克隆差異性表達基因的方法。
方法建立：1992年 Liang P和Pardee首次應(yīng)用DD技術(shù)對比人類乳腺癌細胞與正常細胞所表達的mRNA，以此來克隆癌細胞所特有的基因
目前已應(yīng)用于個各領(lǐng)域：
農(nóng)業(yè)、植物
動物
醫(yī)學(xué)
• 胚胎發(fā)育
• 遺傳病
• 藥物
• 腫瘤
2.mRNA差異顯示原理
是分離差異表達基因的一個重要方法。人類大約含有三萬個不同的基因。在不同的單個細胞中只有10％的基因處于表達狀態(tài)。
生物 體在不同的生理，病理狀態(tài)下，基因的表達水平不同。
生命過程中選擇性表達的基因主要有：發(fā)育與分化、體內(nèi)平衡、對攻擊的應(yīng)答、細胞周期調(diào)節(jié)、老化和程序性細胞死亡等。
差異顯示獲得的只是某個基因的片段，而不是直接獲得全長cDNA克隆。
3.基本程序
選擇表型特性差異顯著對象
展示mRNA的差異
基因差異
克隆與表型差異高度相關(guān)的新基因
4.技術(shù)
• 基本技術(shù)
逆轉(zhuǎn)錄（ RT ）
聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）
凝膠電泳
5.RT-PCR
• 錨定引物 T12-MN，含有12個T可以結(jié)合于mRNA 3`端 poly（A）尾，M為A、C、G 3種堿基之一，N為A、T、C、G 4種堿基之一。
• 熒光錨定引物 ，引物5`端加入T7 RNA多聚酶啟動子并帶有熒光分子
----------- AAAAAAAAAA –3` mRNA
------------XAAAAAAAAAAA–3` 1/3 mRNA
MTTTTTTTTTTTT（12T） Prime
---------YXAAAAAAAAAAAAA –3` 1/12 mRNA
NMTTTTTTTTTTTT（12T）Anchor Prime
•熒光錨定引物：
NMTTTTTTTTTTTT-T7 RNA多聚酶啟動子-熒光分子
（Genomyx company）
因此共有12種錨定引物
• 同位素 標記錨定引物
•隨機引物 （Arbitrary Prime）
可以隨機地與cDNA不同位置多個位點結(jié)合，擴增出不同長度的cDNA片段混合物。
共20種隨機引物，隨機引物-M13
•隨機和錨定引物的多種組合可以展示10000-15000種mRNA