小鼠肝基因組DNA的制備

一、原理

DNA以核蛋白形式存在于細胞核中，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K及鏈霉蛋白酶E的應用使這兩個原則得到了保證。

蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為廣譜蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應體系中，SDS可破壞細咆膜、核膜，并使組織蛋白與 DNA分子分離，EDTA抑制細胞中DNase活性，蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白質，接著用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染。最后用無水乙醇沉淀DNA。為獲得高純度DNA，操作過程中常加入RNase除去RNA。獲得高分子量DNA的關鍵是防止DNase降解DNA。故標本必須新鮮，在提取前細胞就保持完整，核、溶酶體等細胞器應沒有明顯破壞，提取DNA用的離心管等器皿及試劑應消毒。操作在4℃以下進行。

      二、試劑及器材
      1．試劑   
      蛋白酶K：稱取20mg蛋白酶K溶于lml消毒雙蒸水中，－20℃備用。   
      RNase(牛胰)：稱取10mgRNase溶于lml下列混合液中：10mmol/l Tris-HCl，pH8.0； lmmol/L EDTANa2pH8.0；50%甘油。
      10％SDS溶液：稱取10gSDS溶于100ml消毒雙蒸水中，于65℃保溫2小時，貯存室溫備用。
      1×TE緩沖液(pH8.0)：10mmol/L Tris-HClpH8.0；lmmol/LEDTANa2pH8.0。配制后高壓滅菌，4℃貯存。    
      1×TE飽和重蒸酚(pH8.0)    氯仿/異戊醇(24:1V/V)    10mol/LNH4AC，配制后高壓滅菌，4℃貯存
      無水乙醇(AR)  
      70％乙醇
      2．器材
      玻璃勻漿器；
      離心機；
      電泳儀；
      電泳槽；
      紫外透射反射分析儀。
三、操作
      1．組織DNA的提取
      ①取小鼠新鮮肝組織，去除結締組織，用剪刀剪成細小碎塊，加10倍體積TE緩沖液，用玻璃勻漿器在冰浴中中速勻漿
      ②將勻漿液轉入10ml離心管以4000rpm離心10分鐘，棄上清，加10倍體積TE洗一遍，以4000rpm離心10分鐘，棄上清
      ③加適量TE稀釋
      ④取400μl稀釋液于1.5ml的Eppendorf管，緩慢加入10%SDS溶液，至終濃度0.5%  (加20μl)，搖勻直至溶液變粘稠
      ⑤加入Rnase(200μg/ml)至終濃度20ug/m1(42μl)混勻，置37℃保溫60分鐘總體積  (420μl)。
      ⑥加蛋白酶K(20mg/ml)至終濃度100ug/m1混勻(加21ul)，于50℃保溫3小時，并間歇攪動(總體積441μl)。
      ⑦將此溶液冷卻至室溫，加等體積飽和酚抽提，以10000rpm離心10分鐘。
      ⑧取上清加1/2體積飽和酚，1/2體積氯仿/異戊醇抽提一次，以10000rpm離心10分鐘
      ⑨取上清，加等體積氯仿/異戊醇抽提一次，以10000rpm離心10分鐘
      ⑩加1/10體積5MKAc，加2倍體積無水乙醇充分混勻，以12000rpm離心10分鐘，加lml70%乙醇洗沉淀，以12000rpm離心10分鐘，待酒精揮發盡后加20ul TE溶解，4℃儲存
      2．電泳鑒定
      取DNA樣品2μl加上樣緩沖液10μl(含溴酚藍指示劑和甘油)，在0.8%瓊脂糖凝膠進行水平微型電泳，電壓<5V/cm，時間2小時左右。電泳后取出凝膠，用0.5μg/ml的溴化乙錠染色20分鐘，用紫外燈觀察分析。