使用Lipofectamine

前言
Lipofectamine? 2000 試劑 是一項專利配方，用于高效轉染Stealth? RNA或者短的干擾RNA（siRNA）到哺乳動物細胞，以進行RNAi分析（1，2）。該說明書提供了一般的指導以及使用Lipofectamine? 2000轉染Stealth? RNA或者siRNAj進入哺乳動物細胞的步驟。提供推薦的起始使用 試劑 劑量。為了獲得最佳的RNAi實驗結果，需要針對哺乳動物細胞系和目的基因優化轉染的條件。
影響基因阻斷水平（Gene Knockdown Level）的因素
在RNAi實驗中，有許多因素影響目的基因表達程度的降低（例如：基因阻斷），包括：
當設計轉染和RNAi實驗時，需要考慮這些因素。如果需要更多的信息幫助您成功的進行RNAi實驗，查閱標題為"RNAi成功的七個步驟"的文獻。隨同StealthTMRNA訂貨可以得到說明書，也可以從我們的網站（www.invitrogen.com）下載或者通過與技術服務聯系獲得說明書。
轉染的一般性指導
使用Lipofectamine? 2000轉染Stealth? RNA或者siRNA進入哺乳動物細胞時，遵從以下一般性指導：
1 為了獲得最佳基因阻斷結果，每一種細胞系轉染Stealth? RNA或者siRNA的量都需要經過實驗確定。如果您是首次轉染您的細胞系，推薦嘗試使用幾個Lipofectamine? 2000的濃度，并在20-100nM范圍內改變Stealth? RNA或者siRNA的濃度，以確定達到最佳基因阻斷水平所需要的條件。高濃度的Stealth? RNA或者siRNA可能具有細胞系依賴性。注：我們推薦開始時使用40nM Stealth? RNA或者siRNA。
2 在30-50％細胞匯合度時進行轉染。通?；蜃钄嗟姆治鲋辽僖谵D染后24-72小時進行。低密度轉染細胞可以使轉染和分析之間更長的間隙更長，從而使由于細胞過度生長造成的細胞活性損害減少到最低。根據靶基因的特性，高密度轉染的細胞可能更加適合條件的優化。
3 不要在轉染時的培養基中加入抗生素，因為這將會降低細胞轉染的效率和導致細胞死亡。
4 為了獲得更好的結果，可以使用Opti-MEM? I 低 血清 培養基（目錄號31958-062）在形成復合物前稀釋Lipofectamine? 2000和Stealth? RNA或者siRNA寡聚物。
5 可以使用invitrogen BLOCK-iT?熒光寡聚物(BLOCK-iT?　Fluorescent Oligo)(目錄號　2013)幫助優化細胞系的轉染條件。一旦確定了用來轉染的最佳條件，在每一次實驗都包括BLOCK-iT?熒光寡聚物，作為轉染效率的指示劑。如果需要的更多的信息，請參閱BLOCK-iT?熒光寡聚物說明書，說明書可以通過我們的網站下載或者通過撥打技術服務熱線。
需要材料
開始實驗前準備下列試劑：
·目的哺乳動物細胞系（使用傳代數低的細胞；轉染前確信細胞健康和超過90％的存活率）
·目的Stealth? RNA或者siRNA寡聚物（20μM溶解在退火緩沖液中）
·Lipofectamine? 2000試劑（使用前貯存在+4℃）
·Opti-MEM? I 低 血清 培養基（使用前37℃預熱）
·合適的組織培養板及其它