變性膠體電泳與北方雜合分析

mRNA為單股，一般會卷繞成特定的三級結構，并與某些蛋白質結合，而以messenger ribonucleoprotein particles （mRNPs）的型式存在于細胞內；自細胞抽取RNA時，一般會以特定步驟去除蛋白質，但仍難完全破除RNA的二/三級結構。

由于進行電泳分析時，影響核酸泳動速率的因子主要包括核酸的長度與構形（conformation），為了去除核酸構形所造成的影響，一般以電泳分析RNA時都采用變性膠體電泳；在進行這一類電泳分析時，由于RNA已經被變性（denature），影響其泳動速率的因子主要是長度。

一旦RNA以變性膠體電泳解析好，即可進一步進行北方轉印與雜合分析。

在進行RNA變性膠體電泳分析時，如果所要分析的RNA比較小（<1,000 bases），可以選用聚丙烯酰胺膠體（polyacrylamide gel），此時所使用的變性劑（denaturing reagent）主要是尿素（urea）；這個方法一般也被用來分析核酸定序反應的產物。

若所欲分析的RNA 分子較大，可采用變性洋菜膠體電泳（agarose gel electrophoresis），所使用的變性劑為（1） glyoxal/dimethyl sulfoxide （DMSO）或（2）甲醛。

以glyoxal/DMSO系統進行電泳分析時，所使用的電泳緩沖液為10 mMsodium phosphate buffer （pH 7.0）；為了避免電泳進行過程中，電泳槽兩邊的pH落差過大，以致影響電泳的進行，最好能在兩極的間加裝電泳緩沖液循環裝置，而且核酸泳動速率也應盡量放慢。

以甲醛為變性劑時不會有這些問題，因此操作比較省事，但必須注意，甲醛氣體為有毒物質，配制甲醛洋菜膠體及進行電泳分析時應在抽氣櫥里操作。本實驗將采用甲醛洋菜膠體電泳法。

清理電泳槽：能否將RNase去除干凈是RNA相關實驗成功與否的主要決定因子。在進行RNA電泳分析時，為了避免RNase可能帶來的問題，實驗室內最好能騰出一套電泳器材，專門用于RNA的分析。

如果所使用的電泳槽及鑄膠器一般也用于進行DNA分析的話，在進行RNA變性膠體電泳分析前應仔細地加以清理；清理時除了以中性清潔劑徹底沖洗干凈外，最好再用3%過氧化氫（H2O2）浸泡10 min.

儀器用具：

Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器

藥品試劑：

中性清潔劑（abSolve, DuPont NEF971）3% H2O2 （過氧化氫）dH2O/DEPC

方法步驟：

◆ 進行下列步驟時，請務必戴手套！

1）以中性清潔劑仔細清洗電泳槽，再以二次水洗去清潔劑，并稍加晾干。

2）以3%過氧化氫注滿電泳槽，放置于室溫10 min.

3）倒掉過氧化氫溶液。

4）以dH2O/DEPC徹底地沖洗電泳槽。