RACE(rapid-amplification of cDNA ends)簡介
RACE技術的簡介
cDNA完整序列的獲得對基因結構、蛋白質表達、基因功能的研究至關重要。
完整的cDNA 序列可以通過文庫的篩選和末端克隆技術獲得。
末端克隆技術是20世紀80年代發展起來的。RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術。
RACE的優點
與篩庫法相比較，有許多方面的優點
1）此方法是通過PCR技術實現的，無須建立cDNA文庫，可以在很短的時間內獲得有利用價值的信息。
2）節約了實驗所花費的經費和時間。
3）只要引物設計正確，在初級產物的基礎上可以獲得大量的感興趣基因的全長。
實驗室現有的RACE 試劑 盒的簡介
RACE是一種從一個相同的cDNA模板進行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法會產生較少的錯誤條帶。此過程中使用的酶混合物非常適合長鏈PCR。
使用此方法的要求是必須知道至少23－28個核苷酸序列信息，以此來設計5’末端和3‘末端RACE反應的基因特異性引物（GSPs）。
RACE引物的設計：
基因特異性引物（GSPs）應該是：
23－28nt
50－70％GC
Tm值≥65度，Tm值≥70度可以獲得好的結果
需要實驗者根據已有的基因序列設計5‘和3‘RACE反應的基因特異性引物（GSP1和GSP2).由于兩個引物的存在，PCR的產物是特異性的。
反應中涉及到的一些事項
cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因組DNA或總RNA，背景會很高。
RACE PCR的效率還取決于總的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸溫度。
在進行5‘和3’RACE PCR的時候應該使用熱啟動。
表4中給出了所有引物的相互關系。重疊引物的設計會對全長的產生有幫助。另外，重疊的引物可以為PCR反應提供一個對照。并不是絕對的要利用設計的引物產生重疊片段。
引物GSP中的GC含量要在50－70％之間。這樣可以使用降落PCR。避免使用自身互補性的引物序列，否則會產生回折和
如果要用重疊片段來檢測設計的引物，GSp1和GSp2之間至少是100－200堿基。只有這樣才可以用擴增的產物來鑒定設計的引物是否正確。
降落PCR可以明顯的增加RACE PCR產物的特異性。在最開始的循環中，退火溫度高于AP1引物的Tm值，可以增加對特異性條帶的擴增。隨后的退火和延伸的溫度降回到AP1的溫度，可以進行隨后的PCR循環。
形成分子內氫鍵。另外，避免使用與AP1互補的引物，尤其是在3‘末端。
驗證基因特異性引物的對照：
單個引物的陰性對照：只用一個引物GSP來進行陰性對照。這樣不應該產生任何的條帶。如果可以看到明顯的產物，應該改變循環的參數，或重新設計原始引物。
利用兩個GSPS進行陽性對照：（只有兩個GSP可以產生重疊的時候才可以采用此步。）為了確定RNA樣品中目的基因確實表達，利用兩個GSP和接頭連接的cDNA來產生陽性對照。可以產生兩個引物之間的重疊大小的片段。如果沒有這個片段，應該重復cDNA的合成，或者從一個不同的組織或細胞來源進行cDNA的合成。
制備和抽提polyA+RNA
不要使用DEPC處理過的水。
純化完mRNA之后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質量。哺乳動物的mRNA樣品是0.5－12kb的拖帶，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的條帶。非哺乳動物的mRNA應略小。
