RNAi技術策略(哺乳動物細胞篇)

目前RNAi技術已經進入了生物科學研究的許多領域，成為了一種主要的生物學研究工具，發展得相當迅速，并受到了此次諾貝爾獎評審委員會 < language=Java1.1 src="/newsf/js/inpic.js">
的青睞，獲得2006年諾貝爾獎醫學/生理獎。然而這一才歷經十個年頭的技術依然對于許多研究人員來說還是很陌生的，以下是有關RNAi技術在哺乳動物細胞中應用的具體設計策略，主要來自于《遺傳》雜志2005年“RNA干涉（RNAi）技術應用于哺乳動物細胞的研究策略”，希望能給從事或者準備從事RNAi相關實驗的研究人員以幫助。
一、靶siRNA序列選擇
靶siRNAA序列選擇是RNAi實驗成敗的關鍵。哺乳動物細胞RNAi實驗中，使用最廣泛且最有效的是21bp siRNA。siRNA由正義鏈和反義鏈組成，兩條鏈3’端均有2個堿基突出，一般為UU或dTdT，其中正義鏈的前19nt與靶基因序列相同。
1. siRNA設計的原則
SiRNA雙鏈設計時，一般在靶mRNA起始密碼下游100—200bp至翻譯終止密碼上游d0—100bp的范圍內搜尋AA序列，并記錄每個AA3’端相鄰19個核苷酸作為候選si.RNA靶位點。其中AA（N19）TT是最理想的序列，若靶mRNA中無此序列，亦可選用NA（N21）或NAR（N17）YNN（R表示嘌呤，Y表示嘧啶），但在合成時，siRNA的正義鏈3’端需用dT—dT代替。TuscRl等建議設計的siRNA不要針對mRNA的5’和3’端非編碼區，因為這些區域有豐富的調控蛋白結合位點，而UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP（siRNA protein complex，核酸內切酶復合物）結合mRNA，從而影響siRNA干擾的效果。最后還應將候選siRNA序列在GenBank進行BLAST檢索，與非同源基因具有3個或3個以上堿基相異的序列方可選用。
2. 高效siRNA的序列結構特征
除了靶序列位點的選擇，siIRNA序列本身結構特征亦會影響到RNAi效率。RNAi實質上可視為一個RNA與蛋白質互作過程，包括siRNA與RISC結合、RISC的激活以及RISC與靶mRNA的結合和切割，這種互作效應的存在，往往造成siRNA鏈的選擇具有偏愛性。Reynolds等通過對2個基因的180條siRNA序列分析，歸納出以下8個與
siRNA高效性相關的特征:G/C含量低(30%-52%)，正義鏈3’端具較低穩定性（有利于siRNA與RISC的結合和解鏈），無反向重復序列（有利于減小siRNA的有效作用濃度，提高siRNA干擾效率），正義鏈堿基的偏愛性A19（正義鏈中第19位堿基為A，如下表示類同）；A3；U10；無G/C(正義鏈中第19位堿基不為G或C)；無G13。依此規則，Reynolds等設計的30條siRNA中有29條是有效的。Kumiko等亦認為siRNA反義鏈5’端為A/U（即有義鏈U/A）19和最后7個堿基中有5個A/U，會有助于RNAi的高效發揮，且正義鏈G/C1和序列中無連續9nt以上的GC重復片段與基因沉默效率呈顯著相關。有趣的是，該實驗還表明這些規則同樣適用于DNA介導的RNAi（DNA-based RNAi.）實驗。此外，Amarzguioui等發現正義鏈5’與3’端的前3個堿基中A/U含量不對稱(3’端含量應高一些)和A6對siRNA 的活性亦影響很大。根據上述結果，可以初步繪制出一個高效siRNA序列結構的精細與簡略示意圖。
現已知道siRNA的反義鏈決定著靶位點識別，那么在不影響siRNA作用功效的前提下，是否可以對其正義鏈堿基作適當更改或修飾呢？Amarzguioui等研究siRNA不同部位對堿基突變和化學修飾的耐受性，認為siRNA的5’端相對于3’端具有對突變的較高耐受性。有學者認為正義鏈3’突出端的任何堿基修飾對siRNA作用效果均無明顯影響。還有學者認為與反義鏈互補的正義鏈3’端發生1—4個堿基的錯配反而有助于增強RNAI的活性。
二、siRNA制備方法
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括
化學合成
體外轉錄
長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs
PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達
前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經過轉染或者電轉導入哺乳動物細胞后面兩種方法則依賴能夠表達siRNAs的DNA載體或者表達框轉染到細胞中。每種方法都有自己的優點和缺點。哪種是最好的方法，其實取決于實驗目的。這里簡單介紹這5種方法，優點和缺點，以及它們最適合的應用。
siRNA的設計
除了方法3以外，其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列。關于怎樣設計siRNA以及siRNA設計對siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來越多有關設計原則的信息。但這仍然不是精確的。通常來說，每個目標序列設計3—4對siRNAs，在后面的實驗中選擇最有效的那個。網上有提供免費的siRNA設計工具。
體外制備
1.化學合成
盡管化學合成是最貴的方法，但是卻是最方便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。
最適用于：已經找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究
不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素
2.體外轉錄
通過體外轉錄的方法可以合成siRNAs，這樣的成本相對化學合成法而言比較低，是一種性價比高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。以Silencer siRNA Construction Kit為例，一旦得到DNA Oligo模版（這個還是需要DNA合成的，不過DNA合成的成本就比較低了），只要24小時就可以，不需要等很久。這個方法的不足之處是實驗的規模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當的時間——畢竟，化學合成只需要定購就可以了。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達到化學合成siRNAs較高濃度得到的效果（0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection）
最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。
不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。
3.用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA
其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。這個方法是選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一眾siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞，方法和單一的siRNA轉染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要優點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因。現在多數的研究顯示這種情況通常不會造成影響。Ambion公司曾經用它的Silencer siRNA Cocktail Kit(RNase III)試劑盒成功關閉幾個基因，包括c-fos, GAPDH, La, ?-actin, 和Ku-70。
最適用于：快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型
不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療
體內表達
前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉染試劑將siRNAs轉到細胞內。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優點在于不需要直接操作RNA。
4. siRNA表達載體
多數的siRNA表達載體依賴3種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾siRNA在哺乳動物細胞中的表達(1–4)。這3類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾天的時間，同時也需要經過測序以保證克隆的序列是正確的。不過幸好載體容易大量擴增，這個優點足以彌補所有缺陷，特別是當載體在實驗中確實有效的時候。
毫無疑問，siRNA表達載體的優點在于這是眾多方法中唯一可以進行長期研究的方法——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。即使是對轉染帶有篩選標記質粒的細胞進行瞬時篩選，也有助于富集帶質粒的細胞。這也可以幫助解決一些難轉染的細胞由于轉染效率低造成的問題。
最近多個廠家開始研究逆轉錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達，其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便。
最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達siRNA的細胞。長期研究。
不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）
5. siRNA表達框架
siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。這個方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用，包括一個RNA pol III啟動子，一段發夾結構siRNA，一個RNA pol III終止位點。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配！如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩定表達siRNA和長效抑制的研究。
這個方法的主要缺點是PCR產物很難轉染到細胞中。如果有適合的新型轉染試劑能提高SEC的轉染效率的話，那問題就可以解決了。另外，沒有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規模制備。
Silencer Express siRNA Expression Cassette Kits提供人源和鼠源的U6啟動子或者人源H1啟動子元件可供選擇，并已經過c-fos基因抑制的檢驗。
最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子
不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）
三、siRNA的轉染
將siRNA、siRNA表達載體或SECs導入哺乳動物細胞中是誘導RNAI發生的關鍵。有許多轉染試劑可供選用，最常用的是脂質體轉染試劑。某些情況下電穿孔法亦可用，但易導致較高的細胞毒性反應。對于同一細胞系，使用不同的轉染試劑或方法，其效率往往會有所不同；而對于不同的細胞系，使用同一種轉染試劑或方法，效果亦會不同。因此在實驗過程中，有必要嘗試多種試劑或方法來確定最優條件。轉染效率可通過測定細胞的密度，轉染的時間和siRNA與轉染試劑的比例來評價。
四、實驗對照設置
實驗對照是衡量RNAi.實驗數據可信度的一個重要因素。設立陽性對照目的是通過檢測不同濃度的siRNA轉染效率及其最終干擾效果，來確定合適的轉染條件和最低有效的SIRNA濃度。有實驗表明RISC復合物具有飽和性，且過多siRNA會導致細胞毒性和死亡。對于大多數細胞，持家基因（如GAPDH，c-cmyc, β—acion等）是較好的陽性對照，針對這些基因的高效SIRNA序列已有報道。陰性對照是用來檢測RNAi的特異性。通常作為陰性對照的siRNA與選中的siRNA序列有相同堿基組成，但與靶mRNA無明顯同源性。陰性對照的siRNA序列設計有2種方法，一是將特異性siRNA的序列打亂，即“零亂”siRNA（scrambled siRNA），再對其進行BLAST比對，防止與目的靶細胞中的其他基因有同源性；另一種是在特異性siRNA中引入幾個錯配堿基。若引入的是一個堿基錯配，應需考慮它與突變mRNA(即SNP位點)結合能力，最好在設計siRNA時就避免SNP區。
五、RNAi效果檢測
RNAi效果可從mRNA和蛋白質兩個水平來進行量化。在mRNA水平上，Northern Blot和實時定量PCR是兩種常用方法。值得注意的是在進行實時定量PCR時，cDNA合成要用oligo(dT)，而不是隨機引物，且預擴增片段最好位于靶mRNA序列中siRNA位點的上游。蛋白質水平可以通過Western Blot、熒光免疫檢驗法、流式細胞分析術和表型分析來檢測。RNAi一般在轉染后24小時內發生，其引發基因沉默的程度和持續時間依賴于靶蛋白質的降解率(turnover rate of the protein)、siRNA在細胞內的壽命以及其逐漸被稀釋的程度。
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1.PCR產物直接轉染細胞并轉錄siRNA誘導RNAi[siRNA設計專題一]
http://blog.bioon.com/user3/24773/archives/2007/137435.shtml