畢赤酵母表達系統的構建
簡介
畢赤酵母表達系統是一種真核表達系統。它是甲醇營養型酵母菌，有兩個乙醇氧化酶（a lcoholoxida se, Aox) 碼基因 AOXI 和 AOX2，兩者序列相似，AOX1 基因嚴格受甲醇誘導和調控。
當甲醇為唯一碳源時，AOX1 啟動子可被甲醇誘導，啟動乙醇氧化酶的表達，從而用甲醇進行代謝。含 AOXI 啟動子的質粒可用來促進編碼外源蛋白的目的因的表達。與昆蟲表達系統和哺乳動物表達系統相比，酵母表達系統操作簡單，成本低廉，可大規模進行發酵，是較理想的重組真核蛋白質生產制備工具。
材料與儀器
試劑耗材：P. pastoris GS115 菌株、限制性內切酶 Sac I、DNA Marker、瓊脂糖、核酸染色劑溴化乙錠、無水乙醇、高純質粒小量提取試劑盒、YNB（含硫酸銨、不含氨基酸）、蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖、生物素、甘油、甲醇（色譜級）、 SDS-PAGE 凝膠試劑盒、2 × 蛋白上樣緩沖液、BCA 蛋白定量試劑盒、蛋白分子量 Marker、PVDF 膜 PCR 儀、可調式微量移液器、超凈工作臺、恒溫磁力攪拌器、小型臺式高速離心機、凝膠成像系統、電泳儀、顯影系統等等。
步驟
（一）畢赤酵母重組表達載體的構建
1、基因優化設計并合成至 pPIC9K 載體
參照 Gen Bank 中目的基因序列，依照畢赤酵母密碼子的偏好性，在不改變氨基酸序列的前提下，利用密碼子優化軟件對目的基因進行密碼子優化，并在序列的 5'端引入了 Eco R I 酶切位點和 6 × His 的標簽，在 3'端設計了 Not I 酶切位點。將優化構建好的基因序列送至生物公司合成并連接到畢赤酵母表達載體 pPIC9K 中，轉化到宿主菌中獲 DH5α-pPIC9K－目的基因重組菌株。
2、重組質粒的提取及測序
1）將 DH5α-p PIC9K－目的基因菌株接入 LB 液體培養基，220 rpm，37 ℃ 培養過夜，將菌液倒入 1.5 mL 離心管，12000 rpm，離心 1 min，去掉上清培養基，重復上述步驟 3~4 次，將菌體全部富集到離心管中。
2）按照高純質粒小量提取試劑盒說明書進行 pPIC9K－目的基因質粒回收。
3）取 60 μL 準備好的 60 ℃，ddH2O 12 000 rpm，離心 2.5 min，收集 pPIC9K-目的基因質粒產物于 1.5 mL 離心管中，并對重組質粒進行 DNA 測序。
3、質粒線性化
1）線性化 pPIC9K－目的基因質粒
酶切體系 50 μL
pPIC9K 目的基因 34 μL
10 × L buffer 5 μL
Sac I 2.5 μL
ddH2O 8.5 μL
將酶切體系混勻，37 ℃ 酶切 3 h。
2）瓊脂糖電泳鑒定
稱取瓊脂糖粉末 0.3 g 于三角燒瓶內，加電泳緩沖液 30 mL 混勻。微波爐多次加熱熔化瓊脂糖。冷卻至 60~70 ℃，1:5 000 混入溴化乙錠，室溫凝固。將配好的瓊脂糖凝膠置于電泳槽中，加入 TAE 緩沖液，沒過凝膠，10×Loading buffer
與質粒混勻，上樣，電泳 140 V，電泳時間 20 min。
3）乙醇沉淀法回收線性化質粒
向鑒定正確的線性化質粒加入 3 M 的醋酸鈉 5 μL，混勻。加入二倍體積的預冷無水乙醇，混勻后置于 -20 ℃ 30 min，12 000 rpm 離心 20 min，去上清。加入 1/2 體積的預冷無水乙醇，12 000 rpm 離心 20 min，去上清，室溫自然風干，加 20 μL ddH2O 水溶解 DNA。
4、畢赤酵母 GS115 感受態細胞的制備
1）取 GS115 凍存菌，YPD 平板劃線，倒置于 28 ℃ 培養箱中培養 2~3 天。挑取單菌落接種于 5 mL YPD 培養基中，28 ℃，220 rpm 振蕩過夜培養。
2）將培養 GS115 菌液按 1:100 轉接到 50 mL 培養瓶中，220 rpm，30 ℃ 恒溫，220 rpm 振蕩培養過夜，生長至菌液 OD600=1.3-1.5。
3）4 ℃，4 000 rpm 離心 5 min，棄上清，收集沉淀菌體，冰浴 10 min 后，用 50 mL 預冷的滅菌重懸浮細胞；4 ℃，4000 rpm 離心 5 min，去上清。用 25 mL 預冷滅菌水重懸酵母菌，4 ℃，4000 rpm 離心 5 min，去上清。
4）用 20 mL 1M 山梨醇重懸酵母菌，4 ℃，4 000 rpm 離心 5 min，去上清。按照 100 μL 等量分裝，-80 ℃ 凍存。
5、電轉
1）處理電轉杯：ddH2O 清洗兩次，注入 75% 乙醇浸泡片刻后沖洗兩次。將電轉杯電極狹縫對準超凈臺紫外燈，杯蓋朝上，紫外照射消毒 30 min，ddH2O 沖洗 3 次，冰上預冷，超凈臺吹風干燥。
2）電轉：MD 板 28 ℃ 預熱，將線性化質粒和 GS115 感受態混合均勻，輕輕注入電極狹縫中，2 000 V 5.1 ms 電轉。
3）加入 1 mL，1 M 山梨醇，將菌液涂于 MD 板倒置于 28 ℃ 培養 3~6 天，觀察轉化子生長情況。
4）處理電轉杯：用大量 ddH2O 沖洗，并 75% 乙醇浸泡 5 min，無水乙醇沖洗，超凈臺吹風干燥，置于滅菌的離心筒中 -20 ℃ 保存。
6、陽性平板高拷貝克隆篩選
1）將 MD 平板上長出的 His＋克隆，用細胞刮刀將輕輕刮下，與 1 mL YPD 培養基混勻。
2）取 20 μL 涂于不同濃度梯度的 YPD+G418 平板上（濃度依次為 0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）。28 ℃ 培養 2~3 天直至有高拷貝轉化子長出。
（二）重組 E－目的基因的誘導表達及表達條件優化
1、高表達 E－目的基因菌株篩選
1）YPD+G418 板上生長出 5 個菌落編號 1-5，接種于 25 mL BMGY 培養基中，220 rpm，30 ℃ 培養過夜。
2）將 1 mL 種子液轉接到 50 mL BMGY 培養基中，30 ℃ 搖床，220 rpm 培養 24 h，4 ℃，4 000 rpm 離心 5 min。加 50 mL BMMY 重懸菌體，誘導表達，溫度為 28 ℃，初始 pH 值為 6.0，甲醇濃度 2% 誘導 96 h。
3）取 1-5 號誘導后菌液，4 ℃，4 000 rpm 離心 5 min，取上清，40% 的硫酸銨沉淀過夜。
4）4 ℃，12 000 rpm，離心 30 min，用 100 μL ddH2O 溶解沉淀，加入 100 μL SDS 蛋白上樣緩沖液混勻，100 ℃ 加熱 10 min。
5）進行 SDS-PAGE 凝膠電泳實驗，進行判斷 E-目的基因是否成功表達。
2、重組 E-目的基因誘導條件的優化
優化誘導重組 E-目的基因的時間、甲醇劑量、溫度、發酵液 pH。都可以通過 SDS-PAGE 凝膠電泳比較蛋白表達量。
3、重組 E-目的基因的鑒定及純化
通過 Western blot 鑒定目的蛋白重組 E-目的基因、PAS 染色鑒定重組 E-目的基因糖基化、重組 E-目的基因的純化、純化后重組 E-目的基因除鹽及非糖基化條帶去除、BCA 法測定蛋白濃度。
常見問題
1、注意引物的設計，可以多設計幾對進行對比試驗；
2、質粒提取過程中注意 RNA 的去除，可以加 RNase 消化；
3、做質粒回收過程中，要選擇合適的膠濃度，避免損失過大；
4、做 SDS-PAGE 凝膠電泳時，要根據目的基因選擇濃度合適的膠；
5、質粒一定要做線性化處理，環狀質粒的同源重組概率低。
