用克隆化基因在體外合成的蛋白質(zhì)分析 DNA-蛋白質(zhì)相互作用

簡(jiǎn)介

體外合成的蛋白質(zhì)對(duì)于測(cè)定一個(gè)克隆的基因是否編碼一個(gè)特異的DNA結(jié)合蛋白， 以及分析DNA-蛋白質(zhì)相互作用都是極為有用的。為了檢測(cè)DNA的結(jié)合能力，可將標(biāo) 記的蛋白質(zhì)與特異的DNA片段共溫育，用非變性丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)-DNA復(fù) 合物與游離的蛋白質(zhì)分離開來(lái)。

來(lái)源：《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第五版

材料與儀器

含有所需結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒DNA
35S標(biāo)記的蛋白 5×結(jié)合緩沖液 10 mg mL poly (dl-dC) ? poly (dl-dC)或其他的大分子載體 DNA 加樣緩沖液 45%甲醇 10%乙酸 EN3HANCE (Du Pont NEN)

步驟

1) 用合適的限制性內(nèi)切核酸酶切割0.5μg含有結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒DNA (假設(shè)一個(gè)5 kb 的質(zhì)粒），產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)為150?700 bp的片段，這個(gè)片段的大小和內(nèi)切酶切出的其他片段的大小不同。用酚抽提及乙醇沉淀純化。

2) 建立以下15μL的結(jié)合反應(yīng)：

5μL H2O

3μL5×結(jié)合緩沖液

5μL DNA (DNA 片段各 9 nmol/L)

1μL 10 mg/mL poly (dl-dC) . poly (dl-dC)

1μL35S標(biāo)記的蛋白

室溫下溫育20 min。

設(shè)立不含有DNA及含有非特異性DNA (即缺乏結(jié)合位點(diǎn)）的對(duì)照反應(yīng)。

3) 加5μL加樣緩沖液，立刻加樣到5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上。進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)接近膠的底部（根據(jù)緩沖液條件，大約需要1?4 h),不要讓膠的溫度高于室溫。 膠的組成及緩沖液的離子強(qiáng)度可作改變，并且這些改變對(duì)于檢測(cè)蛋白質(zhì)-DNA的相互作用可能很重要。

4) 電泳結(jié)束后，將凝膠置于45%甲醇/10%乙酸中室溫下固定1 h。用EN3HANCE處理膠1 h，干膠，然后進(jìn)行放射自顯影。

常見問(wèn)題

與更為常用的遷移率變動(dòng)分析法中采用32P 標(biāo)記的DNA及不標(biāo)記的蛋白質(zhì)有所不同，這里介紹的分析方法一般用的是35S標(biāo)記的蛋白質(zhì)與不標(biāo)記的DNA。這個(gè)方法的主要優(yōu)點(diǎn)是：任何突變蛋白質(zhì)只要改變DNA模板就可以測(cè)定其DNA結(jié)合性質(zhì)，并且可以檢測(cè)其亞單位結(jié)構(gòu)（如二聚體、四聚體）