從重組溶源菌中制備粗提物鑒定DNA結合蛋白的活性

材料與儀器

大腸桿菌 Y1089
含有或不含10 mmol L MgCl2的LB培養液 1010pfu mLλgtU重組噬菌體液 1 mol L IPTG 抽提緩沖液 5 mg mL溶于抽提緩沖液中的溶菌酶（保存于-20℃)
4 mol L NaCl 32℃培養箱 無菌牙簽 0.025μm圓形濾膜（Millipore VS)

步驟

1) 37℃在LB/麥芽糖/氨芐青霉素培養液中培養大腸桿菌Y1089 hflA150生長至飽和。

2) 用LB/MgCl2培養液將細菌懸液稀釋100倍，取100μL用5μL 1010pfu/mL λgtll重組噬菌體液感染，32℃溫育。

3) 用LB培養液將被感染的細菌懸液稀釋1000倍。取100μL涂于LB/氨芐青霉素平板上，32℃溫育過夜，每平板可獲得約100個菌落。

4) 試驗單個菌落的溫度敏感生長情況。用消毒牙簽將各單菌落分別點種于2塊LB/氨芐青霉素平板上。將其中1塊置于42℃溫育，另1塊置于32℃溫育。

能在32℃而不能在42℃生長的菌落為溶源菌，其出現頻率應為10%?80%。

5) 在LB/氨芐青霉素培養液中將重組噬菌體溶源菌于32℃培養過夜。

6) 取20μL過夜培養物接種于2 mL LB/氨芐青霉素培養液中。于32℃在有良好通風的情況下培養。

7) 當OD690=0.5 (約3 h)時，將溫度調至44℃，培養20 min。

8) 加1 mol/L IPTG至終濃度為10 mmol/L,溫度降低至37℃，繼續培養1 h。

9) 取1 mL經誘導的培養物在室溫下離心45 s。

10) 將沉淀重懸于100μL抽提緩沖液中，迅速在干冰/乙醇中凍結。如果需要，于-70℃保存細胞懸液。

11) 快速解凍細胞懸液。加5 mg/mL溶菌酶至終濃度0.5 mg/mL。在冰上放置15 min。

12) 加4 mol/L NaCl至終濃度1 mol/L，并徹底混勻。4℃在旋轉式混合儀上溫育15 min

13) 4℃離心30min，小心移出上清。

14) 將上清置于0.025μm的圓盤濾膜上，對100 mL抽提液4℃透析60 min。然后在干冰/乙醇浴中迅速凍結，并保存于-70℃。