用制備性凝膠電泳純化寡核苷酸

材料與儀器

40% (m V) 19:1丙烯酰胺 雙丙烯酰胺 16%聚丙烯酰胺凝膠 10×TBE緩沖液 尿素 10% (m V)過硫酸銨 TEMED 甲酰胺加樣緩沖液 仲丁醇（2-丁醇） 二乙醚 1 mol L MgCl2
Saran保鮮膜或其他可透紫外光的塑料膜 增感屏（如 Lightning Plus DuPont NEN) 手提式短波長紫外光源 硅化的玻璃棉 干冰 乙醇浴（-78℃)

步驟

1) 制備一塊20cm×40 cm×1.5 mm的變性膠，帶有4個樣品孔，孔寬為3 cm。對于分離約10?45個堿基長的寡核苷酸，用16%的聚丙烯酰胺/尿素膠（對于更長的寡核苷酸用8%或6%的聚丙烯酰胺/尿素膠）。讓膠聚合30 min以上，然后30 W預電泳 >1 h。

2) 將各寡核苷酸溶于甲酰胺加樣緩沖液中至終體積200μL , 65℃加熱15 min以去除 DNA 二級結構。各孔中分別加50μL樣品，在30 W電泳約4 h，直至溴酚藍移至膠的75%處。

在16%的膠上，溴酚藍與約10 bp的寡核苷酸的移動速度一致，二甲苯青與約30 bp的寡核苷酸的移動速度一致，如果寡核苷酸為25?35 bp長，建議甲酰胺加樣緩沖液中不要加二甲苯青。

3) 移去其中一塊凝膠玻璃板，用保鮮膜覆蓋凝膠。將凝膠剝離并移去另一塊凝膠玻璃板，使凝膠平放在保鮮膜上，用保鮮膜覆蓋凝膠的另一面。

4) 在暗室內，將凝膠置于一增感屏上，用一手提式短波長紫外光源直接照于膠上以觀察DNA。辨明主要的核苷酸帶，用標記筆直接在保鮮膜上標記其位置，要確保光源直接照在該帶上。

5) 用剃刀片小心切下該條帶，盡量不要弄皺凝膠或將凝膠條弄碎。

6) 將凝膠塊置于一15 mL聚丙烯管內，浸泡于5 mL TE緩沖液中，37℃振蕩過夜。

7) 在一支巴斯德吸管中塞上一些硅化過的玻璃棉，并用約5 mL水預淋洗，將含有DNA的上清流過玻璃棉。

8) 反復用仲丁醇抽提將DNA濃縮至<180μL。

9) 用二乙醚抽提DNA 1次，并將其置于真空蒸發器（如Speedvac)中直至所有的二乙醚都被除掉。

10) 用TE緩沖液將液體體積調至180μL,加20μL 3 mol/L乙酸鈉及2μL 1 mol/L MgCl2,在渦旋混合器上振蕩混合。

11) 加600μL的100%乙醇，來回顛倒混合，在干冰/乙醇中冷凍10 min,置于室溫 5 min。室溫下以最大速度離心15 min,沉淀DNA，棄去上清。

12) 加180μL TE緩沖液，在渦旋混合器中振蕩使DNA溶解，加20μL 3 mol/L乙酸鈉 及2μL 1 mol/L MgCl2,在渦旋混合器中振蕩混合。

13) 加600μL 100%乙醇，來回顛倒混合，在干冰/乙醇中冰凍10 min,置于室溫 5 min。室溫下以最大速度離心15 min，沉淀DNA，棄去上清。

14) 加800μL 75%的乙醇，在渦旋混合器中振蕩混合，室溫下以最大速度離心5 min，棄去上清。

15) 在真空蒸發器中小心抽干DNA沉淀（有時靜電將使沉淀蹦出管子）。

16) 將DNA溶解于200μL TE緩沖液中，測定A260和A280。可無限期地保存于-20℃。對于序列特異性的DNA親和樹脂，假定1A260 =40μg/mL DNA。