DNA親和層析法

材料與儀器

制備性的DNA親和層析樹脂
緩沖液Z或其他柱緩沖液（如緩沖液Ze或TM) 配制時含不同的KCl濃度（從緩沖液 Z 0.1 mol L KCl 至緩沖液 Z 1 mol L KCl 對緩沖液Z 0. 1 mol L KCl透析的部分純化的蛋白質(zhì)組分 非特異性的競爭DNA 柱再生緩沖液 柱儲存緩沖液
一次性的層析柱（Poly-prep Bio-Rad) Sorvall SS-34轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子 液氮 硅化的細(xì)玻璃棒

步驟

1) 一次性層析柱中1 mL床體積的DNA親和樹脂，用10 mL緩沖液Z/0. 1 mol/L KCl 洗滌2次，進(jìn)行柱平衡。

2) 在緩沖液Z/0.1 md/L KCl中將部分純化的蛋白質(zhì)組分與非特異性的競爭DNA (由DNA結(jié)合研究確定）結(jié)合。

3) 將混合物在冰上孵育10 min。

4) 12 000 g，4℃離心10 min，以沉淀不溶性的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。

5) 上清在重力作用下加于柱上（如對Sepharose CL-2B柱，15 mL/h)。

6）加樣完畢后，用緩沖液Z/0.1 mol/L KCl洗柱4次，每次2 mL,要淋洗柱的內(nèi)側(cè)壁。

在這一步中，分次用2 mL/份洗滌緩沖液淋洗柱內(nèi)側(cè)壁，從而充分洗滌該親和柱是十分重要的， 用單獨(dú)一次8 mL洗達(dá)不到效果。

7)從柱子上洗脫蛋白質(zhì)，依次加1 mL緩沖液Z/0.2 mol/L、 KCl Z/0.3mol/L KCl、Z/0.4 mol/L KCl 、Z/0.5 mol/L KCl、Z/0.6 mol/L KCl 、Z/0.7 mol/L KCl 、Z/0.8 mol/L KCl、Z/0.9 mol/L KCl之后加 1 mL 緩沖液 Z/1 mol/L KCl 洗 3 次。與所加的1 mL/份緩沖液相應(yīng)，收集各1 mL級分。將這些蛋白質(zhì)樣品在液氮中速凍， 保存于-80℃。樣品一般可保存至少2年。

8)用DNA結(jié)合分析法分析各蛋白質(zhì)組分中序列特異性DNA結(jié)合活性。用SDS-PAGE 電泳及銀染觀察蛋白質(zhì)，估計蛋白質(zhì)組分的純度。

如果需要進(jìn)一步純化，將具有活性的組分合并，依據(jù)KCl濃度，或稀釋（用不含KCl的緩沖液 Z),或透析（對緩沖液Z/0.1 mol/L KCl)至0.1 mol/L KC1。然后將該蛋白質(zhì)組分與非特異競爭性DNA合并，再用新鮮的或再生的DNA親和介質(zhì)進(jìn)行分離。

如果在柱洗脫液中或流出液中都沒有檢測到目的蛋白，那么蛋白質(zhì)可能仍留在柱子里，這就需要 更高濃度的鹽溶液（如2 mol/L的KCl)把蛋白質(zhì)洗脫下來。

9)按如下方法再生親和介質(zhì)：室溫下，停止柱流洗，在柱上加5 mL柱再生緩沖液。用一支硅化了的細(xì)玻棒攪拌介質(zhì)，使介質(zhì)與再生緩沖液混合，讓緩沖液流出柱子。重復(fù)。

10)要保存柱子，則加10 mL柱保存緩沖液，讓其緩慢流過。重復(fù)此步洗滌，然后封閉柱的下端，再加5 mL緩沖液。封閉柱的上端，置于4℃保存。