納豆激酶對(duì)淀粉樣蛋白聚集體的降解作用研究
一、Introduction
全球老齡化的急劇增加引起了人們對(duì)其相關(guān)疾病的關(guān)注。癡呆癥在老年人的慢性疾病中占有突出地位，尤其是阿爾茲海默氏病（Alzheimer's disease，AD）。AD的主要神經(jīng)病理特征之一是淀粉樣蛋白（Aβ42）的聚集和沉積，形成Aβ42寡聚體、纖維和淀粉樣斑塊。Aβ42的聚集體，尤其Aβ42寡聚體損害突觸功能，導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞的死亡。許多研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Aβ42清除率的降低可能是導(dǎo)致AD發(fā)生、發(fā)展的主要和/或起始原因。Aβ42的生理代謝發(fā)生在大腦和外周系統(tǒng)中。腦內(nèi)的Aβ42可以通過(guò)多種機(jī)制被轉(zhuǎn)運(yùn)到外周系統(tǒng)，所以血液中Aβ42水平的降低必然會(huì)減少其在腦內(nèi)的聚集和沉積。因此，清除外周Aβ42有助于減少大腦中Aβ42的沉積，減輕與AD相關(guān)的神經(jīng)病變。開(kāi)發(fā)能降低血液Aβ42聚集體的藥物或制劑，如特異地抗Aβ42抗體或蛋白水解酶是一種可行的方法。
納豆激酶（Nattokinase，NK）是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)分泌的一種天然蛋白水解酶，其在胃腸道中具有較高的穩(wěn)定性且對(duì)人體安全。納豆激酶在體內(nèi)外可催化各種蛋白聚集體的水解，對(duì)心血管健康有許多有利的影響，并可降低AD的發(fā)病率。然而，納豆激酶在體內(nèi)外捕獲（結(jié)合和降解）Aβ42和Aβ40或其聚集體的功效以及對(duì)血液中Aβs水平的影響尚不清楚。
近日，吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在本文中以納豆激酶與Aβ42/Aβ40/Aβ35/Aβ28/Aβ9為研究對(duì)象，在分子水平和AD動(dòng)物模型上研究了納豆激酶捕獲并催化不同種類淀粉樣蛋白的有效性，以揭示納豆激酶降低血液Aβ42/Aβ40水平的可能機(jī)制，并評(píng)價(jià)了其神經(jīng)保護(hù)作用。
二、Results and Discussion
1、納豆激酶與Aβ42三種典型形式的相互作用
分別測(cè)定了納豆激酶對(duì)Aβ42單體、寡聚體和纖維的識(shí)別與結(jié)合功效。納豆激酶能有效結(jié)合Aβ42寡聚體和Aβ42纖維，尤其是Aβ42寡聚體，但卻結(jié)合較少的Aβ42單體。更重要的是，納豆激酶能夠在生理?xiàng)l件下緩慢催化Aβ42低聚物和Aβ42纖維的降解。
2、納豆激酶對(duì)不同類型Aβ結(jié)合的特異性
分別測(cè)定了納豆激酶與Aβ42、Aβ40、Aβ35、Aβ28和Aβ9等及其聚集體的結(jié)合特異性。結(jié)果表明，納豆激酶對(duì)Aβ42和Aβ40的聚集體具有相對(duì)較高的結(jié)合特異性，而對(duì)C端截短的Aβ聚集體的結(jié)合特異性則較低。
3、納豆激酶對(duì)不同形式Aβ42的降解作用
納豆激酶分別與Aβ42單體、寡聚體和纖維孵育1～9 d以研究其對(duì)Aβ42的降解作用。所有形式Aβ42均可被降解，其中納豆激酶對(duì)Aβ42寡聚體的降解能力最強(qiáng)，對(duì)Aβ42纖維次之，對(duì)Aβ42單體最低。分別用抗Aβ42和抗納豆激酶的抗體分析上述催化體系中Aβ42和納豆激酶及其復(fù)合物的，結(jié)果表明：隨著催化時(shí)間的延長(zhǎng)，游離Aβ42和游離納豆激酶分子逐漸減少，相應(yīng)二者的多種復(fù)合物逐漸增加，這說(shuō)明不同形式的Aβ42與納豆激酶均有結(jié)合，并且催化降解產(chǎn)生了截短的Aβ片段。采用高效液相色譜法分析上述催化體系中納豆激酶降解Aβ42所產(chǎn)生的片段。催化產(chǎn)生的Aβ片段的保留時(shí)間介于Aβ28與Aβ35之間，推測(cè)可能為大約28到35個(gè)氨基酸殘基的親水性Aβ肽。不同保留時(shí)間的疏水組分可能是各種Aβ42聚集體（新形成的）或Aβ42(M/O)-納豆激酶的復(fù)合物。綜合以上分析得出，納豆激酶對(duì)Aβ42寡聚體的催化作用最強(qiáng)。
4、納豆激酶對(duì)AD模型小鼠血漿中Aβ42降解作用
分別在體內(nèi)、體外測(cè)定了納豆激酶對(duì)血液中Aβ42水平的影響。在體外，用納豆激酶處理AD小鼠血漿樣本，發(fā)現(xiàn)Aβ42/Aβ40的水平隨著時(shí)間的推移而逐漸下降，尤其是在最初的9天，且顯著依賴于納豆激酶的活性。對(duì)AD模型小鼠連續(xù)灌胃納豆激酶14天后發(fā)現(xiàn)，所有納豆激酶給藥組小鼠的血液Aβ42/Aβ40水平均顯著低于非給藥組（陽(yáng)性對(duì)照組），表明納豆激酶降低了AD小鼠血液中的Aβ42/Aβ40水平。納豆激酶的體內(nèi)催化能力也明顯依賴于納豆激酶的攝入量或其活性。對(duì)灌胃的納豆激酶的總酶活力與剩余酶活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，剩余的納豆激酶活性僅占灌胃納豆激酶總活力的一小部分，表明大部分納豆激酶在攝取和/或進(jìn)入血液過(guò)程中丟失了。盡管如此，進(jìn)入血液系統(tǒng)的納豆激酶也顯示出良好的降解Aβ42/Aβ40的功效。
三、Conclusion
納豆激酶可以捕獲Aβ42/Aβ40及其聚集體，并通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制緩慢催化它們的降解。納豆激酶對(duì)Aβ42寡聚體的催化效率高于對(duì)Aβ42纖維和單體的。納豆激酶對(duì)Aβ42/Aβ40聚集體的催化作用產(chǎn)生了親水性的N末端片段和疏水性的C末端片段。同時(shí)，我們的研究結(jié)果也表明，口服的納豆激酶進(jìn)入血液后可有效降低血液Aβ42/Aβ40水平。因此，納豆激酶是一種可行的血液Aβ42/Aβ40清除劑，具有預(yù)防與治理AD的潛能。
