殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片檢測(cè)槐米中蘆丁含量

蘆丁是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在植物中，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、清除自由基、降血糖、促進(jìn)血管舒張等多種藥理作用，同時(shí)也可用作食品抗氧化劑和色素等，在藥物和食品中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。槐米是豆科植物槐樹(shù)（Sophora japonica L.）的干燥花蕾，是提取蘆丁的主要原料。槐米中蘆丁含量的高低成為決定槐米品質(zhì)的重要指標(biāo)。

隨著新技術(shù)的發(fā)展，碳點(diǎn)具有出色的熒光特性、光穩(wěn)定性、制備原料來(lái)源廣泛、制備過(guò)程簡(jiǎn)單多樣等優(yōu)點(diǎn)。紙芯片具有成本低、便攜、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，與智能手機(jī)聯(lián)用的微流控紙芯片分析傳感方法被廣泛認(rèn)為是快速檢測(cè)發(fā)展的主流方向。目前已有將碳點(diǎn)和紙芯片結(jié)合制備碳點(diǎn)紙芯片的報(bào)道。

近日，武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院研究開(kāi)發(fā)一種殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片，選擇對(duì)蘆丁有高選擇性的熒光碳點(diǎn)，利用殼聚糖的成膜性，于濾紙表面形成碳點(diǎn)殼聚糖薄膜，使碳點(diǎn)均勻的固定于紙芯片中，點(diǎn)樣后樣品斑點(diǎn)由于殼聚糖膜適宜的疏水作用可限制在一定區(qū)域內(nèi)均勻顯色，可同步實(shí)現(xiàn)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和多個(gè)樣品的檢測(cè)。

1 可行性分析

1.1 碳點(diǎn)-蘆丁二元熒光光譜及碳點(diǎn)-殼聚糖-蘆丁三元熒光光譜

紙芯片點(diǎn)樣后在365 nm紫外燈照射下觀察熒光顯色斑點(diǎn)，考察存在或不存在殼聚糖時(shí)，蘆丁對(duì)碳點(diǎn)的熒光猝滅情況。蘆丁對(duì)碳點(diǎn)有明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于蘆丁的殼聚糖也表現(xiàn)出較弱的猝滅作用，蘆丁和殼聚糖的加入均不改變碳點(diǎn)的發(fā)射峰位置。當(dāng)向碳點(diǎn)-蘆丁體系加入殼聚糖時(shí)，發(fā)現(xiàn)碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度繼續(xù)下降，而進(jìn)一步增加殼聚糖濃度時(shí)，碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度下降程度減弱。當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度不小于0.1 mg/mL時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度不再隨殼聚糖質(zhì)量濃度的變化而變化，且和無(wú)殼聚糖體系的熒光強(qiáng)度相差不大，說(shuō)明在較高殼聚糖質(zhì)量濃度下，碳點(diǎn)-蘆丁體系的熒光強(qiáng)度幾乎不受殼聚糖質(zhì)量濃度影響。推測(cè)殼聚糖上的氨基和羥基可能與碳點(diǎn)表面的羥基、氨基發(fā)生作用，但殼聚糖空間構(gòu)型龐大、其自身的氨基和羥基會(huì)形成分子內(nèi)及分子間氫鍵作用，造成其與碳點(diǎn)發(fā)生作用的位點(diǎn)數(shù)量少，從而對(duì)碳點(diǎn)有猝滅作用但不明顯；進(jìn)一步增加殼聚糖質(zhì)量濃度時(shí)，由于殼聚糖的自聚合作用，其表面自由的氨基和羥基進(jìn)一步減少、空間構(gòu)型更大，與碳點(diǎn)發(fā)生作用的位點(diǎn)極少，因而對(duì)碳點(diǎn)-蘆丁體系的影響可忽略。

比較不同蘆丁質(zhì)量濃度下的碳點(diǎn)-蘆丁熒光發(fā)射光譜和碳點(diǎn)-殼聚糖-蘆丁熒光發(fā)射光譜，兩體系的最大發(fā)射波長(zhǎng)一致，曲線形狀相似。進(jìn)一步測(cè)定各體系在最大發(fā)射波長(zhǎng)450 nm處的熒光強(qiáng)度，以蘆丁質(zhì)量濃度為0的體系為對(duì)照，計(jì)算熒光強(qiáng)度改變值ΔF，以ΔF為縱坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)殼聚糖存在時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性仍較好，僅斜率略微下降（即檢測(cè)靈敏度略下降）。綜上可知，殼聚糖（≥0.1 mg/mL）存在對(duì)蘆丁猝滅碳點(diǎn)熒光的影響較小，可將殼聚糖作為載體固定碳點(diǎn)進(jìn)行紙芯片的制備。

1.2 殼聚糖基紙芯片測(cè)定蘆丁含量的可行性

發(fā)現(xiàn)當(dāng)殼聚糖與碳點(diǎn)混合制成鑄膜液并干燥后，在濾紙上形成了含有碳點(diǎn)的殼聚糖薄膜，碳點(diǎn)可均勻固定在殼聚糖薄膜中，能有效承受沖洗。相比碳點(diǎn)紙芯片，殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片背景更明亮，斑點(diǎn)擴(kuò)散不明顯，呈現(xiàn)出很好的顯色均勻性，且斑點(diǎn)顏色隨著蘆丁質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)梯度變化。

2 檢測(cè)機(jī)理探討

天冬酰胺含有氨基和羧基，以它為單一原料經(jīng)熱裂解后可形成表面富含氨基和羧基的碳點(diǎn)。當(dāng)加入蘆丁時(shí)，蘆丁上的羥基能與碳點(diǎn)的氨基和羧基產(chǎn)生氫鍵，由于蘆丁的紫外吸收光譜和碳點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜（λEx=365 nm），推測(cè)蘆丁與碳點(diǎn)發(fā)生了內(nèi)源性熒光猝滅。

在紙芯片法中，當(dāng)將殼聚糖和碳點(diǎn)混合后，基于殼聚糖自身的氫鍵作用和其大分子的空間位阻作用，高質(zhì)量濃度的殼聚糖可在碳點(diǎn)分子周圍產(chǎn)生分子間的堆砌，成膜后即使碳點(diǎn)被固定于殼聚糖膜的縫隙間，碳點(diǎn)表面的氨基和羧基僅有少量與殼聚糖發(fā)生作用，其他大量的氨基和羧基仍裸露于碳點(diǎn)表面，可與蘆丁發(fā)生熒光猝滅。

3 殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片的制備優(yōu)化

3.1 殼聚糖質(zhì)量濃度的影響

殼聚糖可改變紙芯片的親水程度，考察鑄膜液中殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)蘆丁顯色的影響，發(fā)現(xiàn)隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增加，斑點(diǎn)擴(kuò)散程度減緩。殼聚糖質(zhì)量濃度在5、10 mg/mL時(shí)顯色斑點(diǎn)擴(kuò)散明顯，質(zhì)量濃度15 mg/mL時(shí)斑點(diǎn)有部分?jǐn)U散且顯色圖形不規(guī)則，在20 mg/mL時(shí)斑點(diǎn)小且顯色均勻。這是因?yàn)闅ぞ厶堑唾|(zhì)量濃度時(shí)黏度低，能進(jìn)入濾紙間隙無(wú)法成膜，高質(zhì)量濃度時(shí)黏度高，部分殼聚糖未能進(jìn)入濾紙間隙，可在濾紙表面成膜，殼聚糖分子中豐富的羥基和氨基使殼聚糖分子內(nèi)和分子間的氫鍵作用較強(qiáng)，分子間堆砌緊密，使膜具有一定的疏水性，從而表現(xiàn)出紙芯片的親水性變?nèi)酰捎跇悠啡軇榇?水體系，親水性強(qiáng)，因此樣品溶液點(diǎn)樣后顯色斑點(diǎn)限定在一定的區(qū)域。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇殼聚糖質(zhì)量濃度為20 mg/mL。

3.2 鑄膜液中碳點(diǎn)質(zhì)量濃度的影響

隨著碳點(diǎn)質(zhì)量濃度的增加，ΔR值略有增加而后趨于穩(wěn)定，ΔG值和ΔB值呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在碳點(diǎn)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)出現(xiàn)最大值。這是因?yàn)樘键c(diǎn)質(zhì)量濃度較大時(shí)，背景熒光強(qiáng)度大，造成蘆丁點(diǎn)樣后熒光強(qiáng)度變化不明顯，而添加量較小時(shí)，背景熒光強(qiáng)度減弱，且與蘆丁作用的碳點(diǎn)位點(diǎn)變少而造成變化不明顯。故預(yù)聚液中碳點(diǎn)的最優(yōu)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。

4 紙芯片顯色條件的優(yōu)化

發(fā)現(xiàn)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，由于乙醇的蒸發(fā)作用顯色斑點(diǎn)干燥時(shí)間明顯變短，同時(shí)溶液的極性減弱、疏水性增強(qiáng)，也造成顯色斑點(diǎn)的面積增大、ΔR、ΔG、ΔB下降，亦即靈敏度減小。綜合考慮干燥時(shí)間和靈敏度，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

發(fā)現(xiàn)隨著點(diǎn)樣體積的增加，顯色斑點(diǎn)面積略有增加，但干燥所需時(shí)間增加明顯。點(diǎn)樣體積過(guò)小或過(guò)大也造成平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差變大，重復(fù)性下降。綜合考慮干燥時(shí)間、靈敏度及重復(fù)性，選擇點(diǎn)樣體積為4 mL。

ΔR、ΔG、ΔB值在顯色時(shí)間15 min以內(nèi)時(shí)出現(xiàn)波動(dòng)，20 min達(dá)到穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)顯色時(shí)間90、120 min時(shí)ΔR、ΔG、ΔB值仍較穩(wěn)定，可以推斷該體系熒光能夠較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在，長(zhǎng)時(shí)間放置結(jié)果變化較小。選擇顯色時(shí)間為20 min。

5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在最佳的紙芯片制備條件和顯色條件下，滴加不同質(zhì)量濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行拍照，并讀取顯色斑點(diǎn)的ΔR、ΔG、ΔB值，代入不同的數(shù)學(xué)模型中進(jìn)行線性擬合，通過(guò)決定系數(shù)R2的判斷，本實(shí)驗(yàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為ΔG=－0.869C＋27.274（R2=0.994 4）。繼續(xù)呈梯度增加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)蘆丁質(zhì)量濃度為4～120 mg/mL時(shí)，熒光斑點(diǎn)的ΔG值與蘆丁質(zhì)量濃度依舊呈線性關(guān)系。對(duì)空白溶液進(jìn)行11 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，按照檢出限=空白測(cè)定值標(biāo)準(zhǔn)差3 倍/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，得到檢出限為2.8 mg/mL。

6 方法的選擇性

為評(píng)價(jià)方法的選擇性，在蘆丁質(zhì)量濃度為20 mg/mL下，測(cè)定了常見(jiàn)離子、葡萄糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和酚酸類及槐米中存在的黃酮類化合物對(duì)蘆丁熒光顯色斑點(diǎn)的影響。以標(biāo)準(zhǔn)曲線縱坐標(biāo)ΔG值的變化量為考察目標(biāo)。

以ΔG值的變化量在5%以內(nèi)為指標(biāo)，可見(jiàn)常見(jiàn)離子（Na＋、K＋、Mg2＋、Ca2＋、Cl－、F－、SO42－）、蛋白質(zhì)（牛血清白蛋白）、氨基酸（酪氨酸、甘氨酸）、糖（蔗糖、葡萄糖）等大量存在時(shí)對(duì)測(cè)定無(wú)影響；與蘆丁能產(chǎn)生配位作用的金屬離子Zn2＋、與蘆丁結(jié)構(gòu)相似的酚酸類物質(zhì)（綠原酸）在該測(cè)定體系中也能允許較大量存在；黃酮類物質(zhì)（槲皮素、異鼠李素、山柰酚），其濃度為蘆丁濃度數(shù)倍以內(nèi)時(shí)，對(duì)測(cè)定的影響可忽略，由于槐米蘆丁含量很高，槲皮素、異鼠李素、山柰酚等的含量遠(yuǎn)低于蘆丁濃度，上述共存物質(zhì)的影響可忽略。因此該紙芯片測(cè)定體系有較強(qiáng)的選擇性，能適用于槐米等復(fù)雜體系中蘆丁含量的測(cè)定。

7 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)3 批次的槐米樣品平行測(cè)定3 次，計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），測(cè)出槐米中蘆丁的相對(duì)含量平均值為23.85%、22.83%、20.30%，RSD分別為6.1%、5.6%、6.7%，其測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果相近。對(duì)其中一批次樣品進(jìn)行的加標(biāo)回收分析如表3所示，可知碳點(diǎn)紙芯片法的樣品回收率在91.27%～107.5%之間，RSD為6.7%。

8 結(jié) 論

制備了一種殼聚糖基碳點(diǎn)紙芯片并將其成功用于槐米中蘆丁含量的測(cè)定，蘆丁質(zhì)量濃度在4～120 mg/mL時(shí)與其熒光顯色斑點(diǎn)的 ΔG 值呈良好的線性關(guān)系，R2=0.994 4，測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法相近。由于碳點(diǎn)的熒光穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)制備好的碳點(diǎn)紙芯片在干燥條件下保存3 個(gè)月后仍可獲得良好的測(cè)定結(jié)果。紙芯片制備無(wú)繁瑣步驟，僅需將碳點(diǎn)與殼聚糖混合，于濾紙上鑄膜即可得到，紙芯片大小可根據(jù)待分析樣品個(gè)數(shù)自由裁剪，成本低廉，可快速批量制備；樣品液點(diǎn)樣后在紫外燈下即可檢測(cè)，可直接通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液顯色斑點(diǎn)的顏色深淺進(jìn)行半定量分析，也可以采用photoshop軟件或手機(jī)顏色識(shí)別器應(yīng)用軟件讀取斑點(diǎn)顏色G值進(jìn)行定量分析。該法簡(jiǎn)便快捷，能滿足復(fù)雜體系中蘆丁含量的現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定，后續(xù)可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)對(duì)蘆丁有高選擇性、自然光下即可顯色的傳感器。