普洱熟茶對D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用
近日，云南農業大學食品科學技術學院以D-gal皮下注射建立小鼠衰老模型，利用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質譜（UPLC-QE-MS）代謝組學技術，并采用偏最小二乘判別分析（PLSDA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）方法結合變量投影重要度（VIP）與非參數檢驗共同分析對照組、D-gal衰老模型組、普洱熟茶組小鼠腦組織和血清中代謝物的變化規律，通過總體（腦組織）及外周（血清）代謝組學探尋普洱熟茶延緩衰老的潛在代謝物，揭示與普洱熟茶抗衰老作用機制有關的代謝通路，以期為普洱熟茶的作用機制研究提供新的思路。
普洱熟茶是一種以云南大葉種曬青毛茶經微生物發酵加工而成的后發酵茶，可作為一種長期飲用的飲品。本課題組前期研究發現，普洱熟茶可以有效提高D-半乳糖（D-gal）致衰老小鼠肝臟中超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化物酶的活性，降低丙二醛含量，表明普洱熟茶能夠對抗自由基損害，有效預防由氧化應激導致的氧化損傷，具有強抗氧化能力，從而延緩衰老。
1 普洱熟茶對衰老小鼠學習記憶能力的影響
由實驗結果可知，在5 d定位航行實驗中，隨著訓練時間的延長，各組小鼠逃避潛伏期均縮短。與第1天相比，第5天對照組、D-gal模型組、普洱熟茶組小鼠逃避潛伏期分別縮短58.42%、50.54%、32.57%。
由實驗可知，在第6天空間探索實驗中，與對照組相比，D-gal模型組小鼠到達平臺時間顯著延長（P＜0.05）；與D-gal模型組相比，普洱熟茶組小鼠到達平臺時間顯著縮短18.12%（P＜0.05）。結果表明機體的衰老會引起小鼠學習記憶能力衰退，給予普洱熟茶能夠提高衰老小鼠的學習記憶能力。
2 普洱熟茶對衰老小鼠腦組織代謝物變化的影響
采用PLS-DA法將經過預處理的3 組小鼠樣本的UPLC-QE-MS腦組織代謝物數據進行整體分析，結果表明3 組樣本能夠被明顯區分，說明注射D-gal的衰老小鼠和給予普洱熟茶的衰老小鼠腦內代謝物發生顯著變化。為了進一步驗證3 組樣本的分離，并篩選關鍵代謝物，進行OPLS-DA分析，結果表明對照組和D-gal模型組、D-gal模型組和普洱熟茶組樣本顯著分離，數據模型有較好的擬合度及預測能力。其中對照組和D-gal模型組RX2＝0.679，RY2＝0.992，Q2＝0.829；D-gal模型組和普洱熟茶組RX2＝0.631，RY2＝0.968，Q2＝0.681。通過置換檢驗進行模型驗證，200 次置換檢驗后對照組和D-gal模型組的截距R2＝0.826，Q2＝－0.597，D-gal模型組和普洱熟茶組的截距R2＝0.924，Q2＝－0.340，表明模型有較好的預測能力與可靠性。
為了進一步分析普洱熟茶延緩小鼠衰老的相關差異代謝物，根據VIP＞1、P＜0.05的標準，通過KEGG在線數據庫篩選鑒定出26 種差異代謝物，主要分為甘油磷脂類、氨基酸、有機酸、脂肪酰類、核苷等。與D-gal模型組相比，普洱熟茶組中18 種代謝物表達上調，8 種代謝物表達下調。
3 普洱熟茶對衰老小鼠血清代謝物變化的影響
采用PLS-DA法將經過預處理的3 組小鼠樣本的UPLC-QE-MS血清代謝物數據進行整體分析，結果表明3 組樣本能夠被明顯區分，說明注射D-gal的衰老小鼠和給予普洱熟茶的衰老小鼠血清代謝物發生顯著變化。為了進一步驗證3 組樣本的分離情況，并篩選關鍵代謝物，進行了OPLS-DA分析，結果表明對照組和D-gal模型組、D-gal模型組和普洱熟茶組樣本顯著分離，數據模型有較好的擬合度及預測能力。其中對照組和D-gal模型組：RX2＝0.650，RY2＝0.901，Q2＝0.220；D-gal模型組和普洱熟茶組：RX2＝0.583，RY2＝0.980，Q2＝0.735。通過置換檢驗進行模型驗證，200 次置換檢驗后對照組和D-gal模型組的截距R2＝0.897，Q2＝－0.370，D-gal模型組和普洱熟茶組的截距R2＝0.881，Q2＝－0.568，表明模型有較好的預測能力與可靠性。
為了進一步分析普洱熟茶延緩小鼠衰老的相關差異代謝物，根據VIP＞1、P＜0.05的標準，通過KEGG在線數據庫篩選鑒定出11 種差異代謝物，主要分氨基酸、有機雜環化合物、脂肪酸類、植物激素等。與D-gal模型組相比，普洱熟茶組中6 種代謝物表達上調，5 種代謝物表達下調。
4 差異代謝物的聚類分析
篩選得到的差異代謝物通過層次聚類分析能夠更直觀地顯示樣本之間的關系以及代謝物在不同樣本中表達模式上的差異。根據上方樣本聚類的樹狀圖，小鼠腦組織樣本可分成兩個區域，D-gal模型組的6 個平行樣本為第一區域，普洱熟茶組和對照組為第二區域，D-gal模型組的代謝物顏色比其他兩組深；第二區域兩組樣本分支離得越近，說明這兩個樣本所有代謝物的表達量變化趨勢越接近。小鼠血清樣本中代謝物能夠明顯區分為D-gal模型組和其他兩組，但普洱熟茶組和對照組樣本代謝物的表達模式極接近，未完全區分。硫酸膽固醇能夠通過減少氧化應激來調節腦代謝。本研究結果顯示，與對照組相比，D-gal模型組小鼠腦內硫酸膽固醇、二磷酸腺苷核糖等代謝物表達明顯下調，表明小鼠處于氧化損傷狀態。
肌肽已被證明具有神經保護作用，其可穿透血腦屏障，降低與多種病理狀況有關的氧化應激。脂類物質與體內自由基的產生、氧化應激、老化速度等密切相關。本研究結果表明，給予普洱熟茶干預后，組氨酸代謝通路相關代謝物肌肽以及PC（15:0/15:0）、PE（22:2/14:0）等甘油磷脂代謝通路相關代謝物表達明顯升高，提高了衰老小鼠的抗氧化應激能力。D-gal模型組小鼠體內前列腺素D2、5’-磷酸吡哆醛代謝物表達明顯下調，給予普洱熟茶干預后其表達明顯上調，表明花生四烯酸代謝通路和VB6代謝通路被顯著激活。
5 差異代謝物的代謝通路分析
本研究結果表明普洱熟茶的干預可顯著改善小鼠學習記憶減退。本研究基于UPLC-QE-MS代謝組學方法，并結合多元統計學分析研究D-gal致衰老小鼠在普洱熟茶干預下的腦組織和血清代謝變化，鑒定分析出37 種差異代謝產物。通過差異代謝物和代謝通路相關性分析，篩選出4 條腦組織代謝通路，甘油磷脂代謝和組氨酸代謝通路為最顯著的關鍵代謝通路，映射出肌肽、PC（20:5/20:4）、PC（22:5/P-18:1）、PS（20:5/18:1）等10 個關鍵代謝物；篩選出2 條血清代謝通路，VB6代謝通路為最顯著的關鍵代謝通路，映射出前列腺素D2和5’-磷酸吡哆醛2 個關鍵代謝物。這些代謝物可能為延緩衰老的潛在生物標志物。
未來可進行代謝物在體驗證，進一步解析其在延緩衰老過程中的重要作用。將篩選出的差異代謝物進行通路富集分析，小鼠腦組織中篩選到甘油磷脂代謝、VB6代謝、組氨酸代謝和嘌呤代謝通路，其中甘油磷脂代謝和組氨酸代謝通路最為顯著。小鼠血清中篩選到VB6代謝和花生四烯酸代謝通路，其中VB6代謝通路最為顯著。為了更直觀地了解代謝通路映射出的12 個關鍵代謝物，采用箱形圖比較3 組間這12 種物質的含量豐度差異。結果顯示普洱熟茶能夠延緩小鼠衰老，與D-gal組相比，其腦組織中伴隨著組氨酸代謝通路相關代謝物肌肽，VB6代謝通路相關代謝物吡哆醛，甘油磷脂代謝通路相關代謝物PC（20:5/20:4）、PC（22:5/P-18:1）、LysoPC（P-18:1）、PE（22:2/14:0）、LysoPC（18:2）、PS（20:5/18:1）、PC（15:0/15:0）以及嘌呤代謝通路相關代謝物二磷酸腺苷核糖表達量的顯著上調；血清中伴隨著花生四烯酸代謝通路相關代謝物前列腺素D2以及VB6代謝通路相關代謝物5’-磷酸吡哆醛表達量的顯著上調。
