沙門氏菌耐藥及質粒接合轉移特征
沙門氏菌（Salmonella）是一種無芽孢、無莢膜的腸桿菌科革蘭氏陰性直桿菌，廣泛存在于人和動物腸道中，是全球范圍導致食源性疾病爆發的重要病原菌之一。在美國等發達國家，沙門氏菌感染的年發病率高達15.4%，由沙門氏菌引起的疾病爆發和住院治療均高于其他食源性細菌。在中國，每年約3億人次因感染沙門氏菌而患病，達病原菌食源性疾病總數的70%～80%，給食品安全和消費者健康帶來嚴重危害。
質粒是獨立于染色體外、可自主復制、通常攜帶多種抗性和毒力基因的閉合環狀雙鏈DNA，質粒的存在可使宿主菌產生耐藥性和致病性等附加特性。其中，接合質粒是一種與耐藥基因水平傳遞和細菌耐藥性獲得的重要可移動元件。在眾多質粒中，IncI1型質粒有助于blaCTX-M-1基因在禽類和人之間散播，IncN型質粒已被歐洲多個國家的研究者報道攜帶blaCTX-M-1基因。
本研究以分離于我國部分省市的食源、人源和動物源沙門氏菌為材料，篩選攜帶IncI1和IncN質粒的菌株，闡明IncI1和IncN質粒在沙門氏菌中的流行狀況，質粒陽性菌株的藥敏性、與（氟）喹諾酮抗生素耐藥相關基因和超廣譜β-內酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBLs）編碼基因的檢出情況以及該2 種質粒通過水平轉移傳播耐藥基因和耐藥性的水平，以期為保障微生物食品安全問題提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.1.1 菌株
所用菌株為實驗室保存的分離于北京、上海、福建、河南、四川、廣東、廣西、陜西和新疆等地各類零售食品、臨床病人和食品性動物的沙門氏菌（n=956）以及香港理工大學惠贈的攜帶IncI1（n=12）和IncN（n=2）的人源性沙門氏菌（表1）。
1.1.2 培養基
Luria-Bertani（LB）瓊脂、LB肉湯、Mueller Hinton瓊脂、麥康凱瓊脂 北京陸橋技術股份責任公司；XLT4培養基及其補充液 美國BD公司。
1.1.3 抗生素
藥敏性測定用抗生素：萘啶酮酸（nalidixic acid，NAL）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、阿米卡星（amikacin，AMK）、硫酸慶大霉素（gentamicin，GEN）、鏈霉素（streptomycin，STR）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、頭孢曲松（ceftriaxone，CRO）、頭孢西丁（cefoxitin，FOX）、頭孢噻呋（ceftiofur，TIO）、頭孢哌酮（cefoperazone，PER）、氨芐西林（ampicillin，AMP）、阿莫西林/克拉維酸（amoxicillin-clavulanic acid，AMC）、氯霉素（chloramphenicol，CHL）、四環素（tetracycline，TET）、復方新諾明（trimethoprim/sulfamethoxazole，SXT）和多黏菌素B（polymyxin B，PB）（均為分析純） 美國Sigma公司。
1.1.4 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物
ESBLs編碼基因（blaTEM、blaCTX-M、blaOXA、blaACC和blaPSE）和質粒介導的（氟）喹諾酮耐藥相關基因（qnrA、qnrB、qnrS、acc(6’)-Ib和qepA）擴增引物，IncN和IncI1不相容群質粒PCR復制子分型用引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。
1.1.5 試劑
1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）、5×TBE緩沖液、瓊脂糖凝膠、dNTP、PCR buffer、MgCl2、rTaqTM DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司。
1.2 儀器與設備
Mycycler PCR儀、DNA電泳和凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；Milli-Q純水儀 法國Millpore公司；磁力加熱攪拌器 美國Fisher公司；微波爐 廣州美的微波爐制造有限公司；-40 ℃低溫冰箱、-80 ℃低溫冰箱日本Sanyo公司；百分之一天平、萬分之一天平 德國賽多利斯公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安高壓儀器設備有限公司；隔水式恒溫培養箱 北京科偉實驗儀器有限公司；移液器、高速離心機 德國Eppendorf公司；生物安全柜 美國Labgard公司；超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司；濁度儀 美國DADE Behring公司；數顯恒溫水浴鍋 北京科偉試驗儀器有限公司；恒溫搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 IncI1和IncN質粒分型
基于PCR復制子分型方法對質粒進行不相容群分析，用單一PCR法篩選攜帶IncI1和IncN不相容群質粒的菌株。采用煮沸法制備DNA模板。PCR條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min，相應退火溫度條件下1 min、72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min。退火溫度由相應基因的引物序列決定。2 μL PCR產物經凝膠電泳和溴化乙錠染色后于凝膠成像系統下檢測。在低溫條件下將PCR粗產物送至上海桑尼生物科技有限公司測序，采用在線比對軟件BLAST進行比對，確定質粒類型。
1.3.2 藥敏性測定
采用美國國家臨床實驗室標準化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institution，CLSI推薦使用的瓊脂稀釋法，測定供試抗生素對沙門氏菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations，MIC），參考CLSI的標準解讀藥敏性測定結果。
1.3.3 耐藥基因檢測
采用普通PCR檢測相關耐藥基因，引物如表2所示，PCR模板（菌株總DNA）、擴增體系和具體條件
1.3.1節所示。
1.3.4 質粒膜接合實驗
基于IncI1和IncN質粒陽性菌株及受體菌藥敏性結果，選擇分別攜帶IncI1質粒和IncN質粒的沙門氏菌作為供體菌，不含該2 種質粒的大腸桿菌和沙門氏菌為受體菌，采用膜過濾法進行接合。接合方法如下：取OD600 nm為0.6的供體菌和受體菌菌液各1 mL于5 mL LB肉湯中混勻，轉入孔徑0.22 μm的濾器過濾，過濾后將濾膜緊貼于不含抗生素的LB瓊脂培養基表面，有菌的一面向上，37 ℃過夜培養。用5 mL LB肉湯清洗過夜培養的濾膜，梯度稀釋后分別涂布于同時含有CRO（32 μg/mL）和CIP（16 μg/mL）或同時含有STR（64 μg/mL）和CIP（16 μg/mL）的LB平板上，雙抗平板的選擇根據供體菌和受體菌的耐藥表型確定，每個梯度3 個平行，37 ℃培養48 h，計數。
將OD600 nm為0.6的受體菌梯度稀釋后均勻涂布于不含抗生素的LB平板，每個梯度3 個平行，37 ℃培養過夜，計數，用于菌液起始濃度的確定。同時，將供體菌和受體菌分別涂布于相應的雙抗平板上，每株菌3 個平行，37 ℃培養48 h，作為對照。培養結束后，確定供體菌和受體菌不能在相應的雙抗平板上生長時，再在涂布有不同稀釋度接合子的雙抗平板上隨機挑選10 個單菌落，以表2中的引物進行PCR擴增，擴增產物采用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳和測序分析，確定IncI1和IncN質粒在接合過程發生了水平轉移。接合子攜帶的耐藥基因和藥敏性檢測方法同1.3.1節和1.3.2節。
1.4 數據統計分析
利用Minitab?18.1對實驗數據進行處理，用χ2檢驗比較不同條件下的檢出率，P＜0.05，差異顯著。
