3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)操作指南
3T3-L1細(xì)胞是一種小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系,最早于1974年由Green和Kehinde等人從小鼠胚胎中分離得到。由于其具備在體外分化為類脂肪細(xì)胞的能力,這種細(xì)胞系被廣泛應(yīng)用于肥胖和糖尿病等代謝性疾病的研究中。
本期細(xì)胞學(xué)堂將詳細(xì)解讀3T3-L1細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化步驟及注意事項(xiàng),幫助您輕松掌握實(shí)驗(yàn)技巧,確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。
本次實(shí)驗(yàn)使用代次為P5的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化,但具體以當(dāng)下的細(xì)胞狀態(tài)為準(zhǔn)。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,建議盡量使用早代次的細(xì)胞開始誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。
注:此次3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)是普諾賽內(nèi)部測(cè)試數(shù)據(jù),僅供參考。
3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化步驟
(以六孔板為例)
1.3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)正常培養(yǎng),細(xì)胞的融合度達(dá)到80~90%時(shí),即可用胰酶消化,計(jì)數(shù)。
2.按2~3×104 cells/cm2的細(xì)胞密度接種在六孔板中(具體接板數(shù)量以實(shí)際預(yù)實(shí)驗(yàn)情況為準(zhǔn)),每孔加入2 mL的3T3-L1細(xì)胞完全培養(yǎng)基。
3.將均勻接種好的3T3-L1細(xì)胞置于37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
4.當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%~95%時(shí),小心的將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走,向六孔板中加入2 mL的3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液開始誘導(dǎo)。
5.A液誘導(dǎo)2天后,吸走六孔板的誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基,每孔加入2 mL 3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)1天。
6.使用A 2天+B 1天交替的方法持續(xù)誘導(dǎo)。
7.誘導(dǎo)試劑配制方法可參考3T3-L1 (小鼠胚胎成纖維細(xì)胞) 成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的說(shuō)明書,并按照說(shuō)明書操作對(duì)誘導(dǎo)結(jié)束后的細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色。
誘導(dǎo)注意事項(xiàng)
開始誘導(dǎo)時(shí)的密度可控制在90%~95%或者剛好長(zhǎng)滿,注意避免細(xì)胞過(guò)度飽和導(dǎo)致細(xì)胞卷邊漂起或者狀態(tài)不佳,這可能會(huì)影響后續(xù)的分化效果。
鋪板需均勻,鋪板不均勻可能會(huì)導(dǎo)致分化不均勻,分化比例低,分化過(guò)程中細(xì)胞漂浮。
從添加誘導(dǎo)劑開始到分化結(jié)束,大概需要2周左右的時(shí)間(具體還需根據(jù)脂滴出現(xiàn)的情況,適當(dāng)延長(zhǎng)或者縮短誘導(dǎo)時(shí)間)。
3T3-L1細(xì)胞添加誘導(dǎo)劑時(shí),手法要特別輕,誘導(dǎo)試劑需要提前37℃復(fù)溫后使用,加液時(shí)盡量用槍頭貼壁逐滴加入,讓液體慢慢流下,這樣對(duì)細(xì)胞的沖擊最小,否則極容易造成細(xì)胞卷邊飄起。
實(shí)驗(yàn)中所使用的溶劑遵循現(xiàn)用現(xiàn)配原則。
染色使用的油紅O染色液需要按說(shuō)明書稀釋后使用,飽和油紅O染色液不容易著色。
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