細胞爬片制作

細胞爬片是一種將細胞培養在玻璃或塑料表面上，使其附著并擴展的技術。一般是讓玻片浸在細胞培養基內，使細胞在玻片上生長。這種技術可以用于觀察細胞形態、運動、細胞與細胞之間相互作用等。利用細胞爬片進行體外實驗可排除體內諸多干擾因素的影響，方便對細胞進行各種干預處理。

做免疫熒光（IF）、原位雜交（FISH）、凋亡檢測（TUNEL）等實驗時，都需要制備細胞爬片，而爬片質量會影響到最后的圖片呈現效果以及實驗數據的精準性。

操作步驟

01爬片準備

1.根據實驗選擇合適大小的爬片。

2.爬片處理，首先浸酸：5%稀鹽酸浸泡過夜（最好逐片浸入，多片同時浸入會引起多片粘連、浸洗不充分），第二天先用自來水沖洗20次，再用三蒸水沖洗2次（清除殘留酸液）。

3.將爬片置于無水乙醇浸泡過夜（浸洗脂類污漬），75%乙醇長期保存備用（無需高壓滅菌）。使用時鑷子取出爬片，酒精燈烘烤，放入孔板。

02細胞爬片

1.收集貼壁細胞進行計數，按照實驗需求用完全培養基稀釋細胞至合適濃度。

2.加細胞前，先在每個孔里準備放爬片的位置滴加少量培養基（目的是使爬片與培養皿靠液體的張力粘合到一起），然后輕放爬片（注意不要產生氣泡，防止加細胞懸液時爬片漂起）。整個過程注意無菌操作。

3.根據實驗需求接種合適細胞量到培養器皿內。

03.爬片的固定

固定液的選擇：

1）多聚甲醛（常用4%）：

可用于免疫電鏡、免疫組化、免疫熒光以及TUNEL染色等。室溫固定15~30 min后可進行后續實驗。

2）4%中性甲醛：

又名“10%中性福爾馬林”，應用廣泛，常用于免疫組化、免疫熒光以及TUNEL染色等。形態結構保存好，且穿透性強，但甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；分子間交聯形成的網格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露，可能造成假陰性的染色結果。室溫固定15~30 min后可進行后續實驗。

3）其他：

如冷丙酮、75%~95%乙醇等，具體的以實驗要求為準。

以多聚甲醛為例進行固定：

1.準備4%多聚甲醛（PFA），于4℃冰箱中保存，使用時常溫復溫。

2.在培養板中將已爬好細胞的爬片用PBS浸洗3次，每次3 min，輕輕晃動，避免將細胞沖掉。

3.用4%的多聚甲醛固定爬片15 min（細胞自帶熒光時注意避光），PBS浸洗爬片3次，每次3 min。

4.Triton X-100（PBS配制，濃度根據實驗調整）室溫通透20 min。

5.PBS浸洗爬片3次，每次3 min。

6.按實驗需求進行后續實驗。

04細胞爬片封片

封片前根據實驗需求決定是否需要孵育抗體或復染核。孵育好后用PBS浸洗3次，用吸水紙吸干爬片上的液體，封片液封片。

注意事項

固定好的細胞爬片建議盡快用于實驗，以免影響實驗效果。

取爬片時注意控制力度，夾取時盡量夾取爬片邊緣，以免夾破爬片或造成劃痕。

細胞爬片取出后，一般用PBS潤洗3遍（潤洗操作盡量輕柔，以免細胞脫壁；根據研究目的，可調整潤洗次數，避免細胞脫壁），然后做固定。

對于貼壁性較差的細胞，可提前用包被液（明膠，多聚賴氨酸，鼠尾膠原等）包被爬片。

如果細胞帶有熒光標記，所有操作步驟盡量在較暗處進行。

常見孔板細胞爬片（圓形）大小參考：