視神經橫斷模型及熒光金逆行標記

原理

作為中樞神經的重要組成部分，視神經及其胞體已成為中樞神經損傷修復的重要研究對象。中樞神經損傷修復研究中的許多重大發現，最初都是以視神經損傷為模型開展的。其中最為著名的，是蘇國輝和Aguayo采用周圍神經移植誘發視網膜神經節細胞（以下簡稱節細胞）再生的開拓性研究。視神經由眾多神經纖維組成，其胞體是位于視網膜層的節細胞，在模型制作過程中可分別將節細胞的胞體和軸突分開處理。視神經損傷模型制作簡便，重復性好。視神經損傷后，節細胞會大扭死亡。因此，節細胞的保護及視神經再生是研究的兩個重要方面。這個模型可以用來研究神經元保護及神經再生的過程及機制；另外此模型結合藥物治療及分子生物學檢測方法可以為保護神經元及促進視神經再生的藥物開發及機理研究提供一個很好的實驗載體。兩種可用于中樞神經元保護和軸突再生研究的視神經損傷模型，即視神經橫斷(optic nerve transection)及夾傷模型(optic nerve crush)。視神經橫斷模型為經典的模型，視神經保護研究只需要直接在視神經斷端標記熒光金，而再生研究需要移植外周神經，并在外周神經斷端標記熒光金。其特點是重復性好，但是研究再生時移植坐骨神經手術步驟較為復雜。視神經夾傷模型研究節細胞保護及再生實驗需要在外側膝狀體和上丘進行熒光金標記。其特點是，模型制作簡便，但是由于夾傷的力度較難控制，模型穩定性較差。這兩種模型標記熒光金后都需要進行視網膜鋪片。

材料與儀器

實驗動物
1%戊巴比妥鈉 熒光金(Fluorochrome）
手術顯微鏡 顯微手術器械

步驟

(1)以1%戊巴比妥鈉溶液(50mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。

(2)將大鼠固定于手術臺上，沿中線切開頭皮掛線曠置。

(3)手術顯微鏡下沿眶內緣小心分離左眶軟組織，盡量向兩眥延伸。

(4)依照解剖層次分別牽開眼外肌肉，充分暴露眼球后極和視神經眶內段。

(5)縱向切開視神經背側鞘膜，注意避免傷及視網膜中央動脈。

(6)在眼球后極1.5mm處以顯微剪剪斷視神經。

(7)剪取小片封口膜并展薄，戳一小孔，容視神經殘段通過，將一小塊明膠海綿浸吸5%熒光金溶液，包埋視神經殘段以逆行標記節細胞。將封口膜折疊包裹視神經殘段及明膠海綿填塞于眶后。

(8)術畢縫合眼眶，以及頭皮，并抗感染處理，調整頭皮張力，可容雙瞼閉合。術中及術后檢查手術側眼底血供情況。

(9)術后相應時間點處死動物取眼球進行視網膜鋪片。

結果：

1.在手術過程中以及術后注意觀察眼底是否出血或者缺血，造成這兩者原因主要為眼損傷或剪斷視網膜中央動脈，出現這兩種情況的動物均不能用于后續試驗。

2.在視網膜鋪片后進行顯微鏡下觀察，熒光金標記清楚，無未標上的區域，表明熒光金逆行標記試驗成功（圖4-12)。

3.熒光金標記的節細胞胞體多呈卵圓形，邊界清晰，大小不一；其分布由中央向周邊部逐漸稀少；在損傷2d后逐漸開始出現標記的小膠質細胞，為吞噬了死亡的節細胞而成金黃色，其形態為胞體細長，形態不規則，較易與節細胞區分開來。

注意事項

1.造模過程中不要損傷視網膜中央動脈，視網膜中央動脈損傷會導致節細胞快速死亡。

2.造模過程中不要損傷視神經，切開視網膜背部鞘膜、剪斷視神經、夾傷視神經過程中除損傷部位外其他部位不要用攝子夾持，需要固定視神經時，應夾住視神經根部鞘膜。

常見問題

1通常麻醉大鼠，切開頭皮后，在大鼠兩眺對稱靠外兩側分別掛兩根線以保證手術視野清晰可見，此時掛線不好有可能會妨礙手術過程中的視野。出現此問題可以反復調整掛線，直到手術視野清晰可見為止。

2.分開眼外肌肉時務必沿著解剖層次分離，通常將外斜肌和上直肌分開可見靜脈竇；掛線分開眼外肌肉后會清晰可見一側靜脈竇，此靜脈竇可以作為標志物，視神經在其前下方，分開前下方的眼外肌肉便可看到視神經。

3.視網膜中央動脈在視神經0.5mm以前走行于視神經內，而在0.5mm后走行于視神經鞘膜內。因此為了防止損傷視網膜中央動脈，最短夾傷或剪斷視神經的長度應為0.5mm,并且應該切開視神經鞘膜，夾傷或剪斷視神經時應從鞘膜上夾傷或剪斷視神經，防止損傷鞘膜上的視網膜中動脈。

4.手術中使用的顯微器械對手術的成敗非常關鍵，尤其要保證分離視神經用的攝子及用于劃開視神經鞘膜的維納斯剪尖端盡量不受磨損。根據攝子尖端的不同粗細，選擇性的用于分離頭皮、肌肉和神經。手術需要反復練習。

5.熒光金標記的成功由多個步驟控制著。首先視神經殘端包裹熒光金時，封口膜裁剪的大小要適中，避免過大或過小；膜中央用于插入視神經的空洞寧小勿大，否則容易造成明膠海綿的脫落。沾熒光金的明膠海綿不能太大，太大容易造成脫落。熒光金容易光照猝滅，在視網膜鋪片時應避光。

6.開展視網膜鋪片實驗時，取出眼球后往往分不清楚眼睛的鼻側或顳側，因此在取眼球時可以在鼻側用小針頭扎一小眼，取出眼球后沿小眼剪－短切口，分離視網膜后在其對側及上下側分別剪一切口，這樣便可容易分清四個象限（左上為鼻上，左下為鼻下，右上為顳上，右下為顳下）。