質粒載體中平末端片段的克隆

1．分別設立兩個反應，用適當的限制性內切核酸酶消化1~10μg質粒DNA和外源DNA片段，使它們能產生平末端。

2．苯酚：氯仿抽提與乙醇沉淀法純化出已被消化的載體和外源DNA片段。

3．分別用TE（pH 8.0）重新溶解純化出的兩種DNA沉淀，使終濃度為100 ng/ml。 假設1 bp相當于660 Da，計算DNA的終濃度（pmol/ml）。

4．將載體DNA去磷酸化。

5．按下表將適量的DNA轉移至無菌的0.5 ml離心管：   管號DNAA和E載體1 [60fmol (~100ng)]B外源插入片段2[60fmol (~10ng)]C和F載體1（60fmol）和外源插入片段3（60fmol）D線狀載體（5’-磷酸化）（60fmol）G環狀載體[60fmol (~10ng)]1 載體DNA已進行去磷酸化2 外源目的DNA可以連接接頭。3 連接反應中，質粒載體和插入的DNA片段摩爾比一般為1：1。DNA的總濃度應約為10ng/μl。 a.       A、B和C管中加入：   10×連接緩沖液      1.0μl   T4噬菌體連接酶      0.5 Weiss單位   5 mmol/L ATP        1.0μl   H2O                  補至8.5μl   30%PEG 8000          1~1.5μlb.      D、E和F管中加入：   10×連接緩沖液      1.0μl   5 mmol/L ATP         1.0μl   H2O                  補至8.5μl   30%PEG 8000          1~1.5μl   不加DNA酶 

6．連接反應體系置于16℃水浴溫育過夜或20℃水浴溫育4 h。

7．用每份稀釋的連接產物轉化感受態大腸桿菌。轉化時，應包括用標準方法制備的已知量的超螺旋質粒DNA作為對照，以檢查轉化效率。管號DNA連接酶（有/無）預期轉化克隆數A載體1+~03B插入片段+0C載體1和插入片段+比F管高5倍D載體1-~0E載體2-比D管高50倍F載體和插入片段-比D管高50倍G環狀質粒-2×1051 去磷酸化2 未去磷酸化3 如果出現來自去磷酸化的載體DNA自身連接產物的轉化子，是由于用堿性磷酸酶處理時未能除盡5’端的磷酸基。